Adenofection: En metode til at studere den rolle molekylchaperoner i Cellular morfologiske dynamik ved Udtømmelse-Rescue Eksperimenter
Summary
We describe a method for depletion-rescue experiments that preserves cellular integrity and protein homeostasis. Adenofection enables functional analyses of proteins within biological processes that rely on finely tuned actin-based dynamics, such as mitotic cell division and myogenesis, at the single-cell level.
Abstract
Cellulære processer såsom mitose og celledifferentiering er reguleret af ændringer i celleform, der stort set afhængige af korrekt remodellering af celle cytoskeletale strukturer. Dette indebærer montage-adskillelse af højere orden makromolekylære strukturer på et givet tidspunkt og sted, en proces, der er særligt følsomme over for forstyrrelser forårsaget af overekspression af proteiner. Metoder, der kan bevare protein homeostase og opretholde nær-til-normal cellulær morfologi er særdeles ønskeligt at bestemme den funktionelle bidrag af et protein af interesse i en lang række cellulære processer. Forbigående udtømning-redning eksperimenter baseret på RNA-interferens er stærke metoder til at analysere protein funktioner og strukturelle krav. Men genindførelse af målproteinet med minimum afvigelse fra dets fysiologiske niveau er en reel udfordring. Her beskriver vi en fremgangsmåde benævnt adenofection der blev udviklet for at undersøge den rolle af molekylære chaperoner end partnere i den normale drift af delende celler og forholdet til actin remodeling. HeLa-celler blev depleteret for BAG3 med siRNA-duplexer målretning 3'UTR region. GFP-mærkede BAG3 proteiner blev genindført samtidigt i> 75% af cellerne under anvendelse af rekombinante adenovira koblet til transfektionsreagenser. Adenofection mulighed for at udtale BAG3-GFP-proteiner på nær fysiologiske niveauer i HeLa-celler depleteret for BAG3, i mangel af en stress-respons. Ingen effekt blev observeret på niveauerne af endogene Heat Shock Protein chaperoner, de vigtigste stress-inducerbare regulatorer af protein homeostase. Endvidere ved at tilføje baculovira driver ekspressionen af fluorescerende markører på tidspunktet for celle transduktion-transfektion, kunne vi dissekere mitotiske celle dynamik ved tidsforskudt mikroskopisk analyser med minimal forstyrrelse af normal mitotisk progression. Adenofection gælder også for svære at inficere museceller, og egnet til funktionelle analyser af myoblast differentiation ind myorør. adenofection tilvejebringer således en alsidig metode til at udføre struktur-funktion analyser af proteiner involveret i følsomme biologiske processer, der er afhængige af højere orden cytoskeletale dynamik.
Introduction
Funktionel inaktivering af genekspression i pattedyrceller er den gyldne standard for at dissekere proteinfunktioner. Nyudviklede teknologier genom-redigering baseret på anvendelsen af stedspecifikke nucleaser såsom zink-finger nukleaser og grupperet regelmæssigt spatierede korte palindrome gentagelser (CRISPR) / CAS9 nu tillade generering af cellelinier med målrettet gendeletion og mutation 1,2. Disse nye metoder skal revolutionere den måde, vi studerer protein funktion og vores forståelse af genetik for humane sygdomme. I nogle tilfælde, dog langvarig eller fuldstændige gen knockout ikke er ønskelig og kan provokere sekundære celle kompensationsordninger. Frembringelsen af genetisk modificerede cellelinier kan også være begrænsende i forbindelse med behandlingen primære cellekulturer med begrænset proliferation kapacitet, eller når der søges screening af et stort sæt mutationer i forskellige celletyper. Dette er ofte nødvendigt for at bestemme afhængigheden af en celle biological proces på strukturelle krav til et protein. Med henblik herpå reversibel knockdown af RNA-interferens, der muliggør transient depletion-rednings eksperimenter i forskellige cellulære baggrunde stadig en enkel og effektiv metode til at udføre struktur-funktion analyser af et protein af interesse 3. Men en væsentlig ulempe ved denne fremgangsmåde er vanskeligheden ved at opnå effektiv lyddæmpning og at genindføre proteinet af interesse eller dets varianter ved nær fysiologiske niveauer i et flertal af cellepopulationen. Dette er afgørende for, at omfattende undersøgelser, der forsøger at korrelere funktionelle virkninger set på niveau med enkelte celler (hypomorphic fænotype) med dem, der ses i celle population assays, f.eks på protein-protein interaktioner.
Brug af klassiske transfektionsmetoder, kan man næppe opnå homogen og lav ekspression af eksogene proteiner i en stor population af celler. Transduktion af celler med rekombinante viraligesom adenovirus ofte giver mere normaliseret udtryk for eksogene proteiner. Alligevel er adenovirus optagelse begrænset af CAR-receptoren, som er fraværende i ikke-humane celler eller kun svagt udtrykt i nogle humane celletyper. Endvidere den cellulære optagelse af adenovira aktiverer signalveje, der regulerer celleform og adhæsion 4-6. Dette er naturligvis ikke ønskeligt, når studerer reguleringsmekanismer af celle morfologiske dynamik. Vi stod overfor denne problematiske, da vi foretog funktionelle analyser af en chaperone kompleks, BAG3-HSPB8, i celledeling og aktin dynamik. Banebrydende arbejde havde beskrevet en rolle for denne chaperone kompleks på protein kvalitetskontrol og autophagy under stress 7,8. De fleste af disse undersøgelser har imidlertid påberåbt proteinoverekspression, forudsat at chaperoner normalt opreguleres under stress. Det har efterladt åben hvorvidt BAG3, i kompleks med HSPB8, kan bidrage til den normale drift af delende celler, der udtrykker thESE chaperones ligesom mange kræft celletyper 9. Især om chaperone komplekset bidrager til ombygningen af actin-baserede strukturer, der styrer mitotisk progression var af stor interesse på grund af de nye forbindelser mellem hspB chaperones og cytoskeletale dynamik 10. For at løse dette problem, vi søger at udvikle en effektiv metode til udtynding-redning eksperimenter, der ikke ville forstyrre mitotisk progression eller cellulær morfologi, og som ville bevare protein homeostase at undgå sekundær forstyrrelse af dynamikken i makromolekylære komplekser regulerer celle-shape ændringer . Således ideelt set bør udføres depletion-add-back af genet af interesse samtidigt.
Anvendelsen af komplekser af adenovirus med en kationisk polymer eller lipider er blevet beskrevet at fremme genoverførsel in vitro og in vivo 11,12. For eksempel calciumphosphat (CaPi) synes at danne et bundfald medadenovirus at forbedre virus binding-indrejse via en CAR-uafhængig vej 13. Faktisk fandt vi, at kombinere adenovirus-baserede celle transduktion og transfektion med kationiske forbindelser kunne øge effektiviteten af de udtømning-redning eksperimenter. Dette tillod os at sænke mængden af virus ved 3- til 20-fold, afhængigt af cellelinjen og genet af interesse, og drage fordel af et bredere vindue for at tilpasse ekspressionen af eksogene proteiner på nær endogene niveauer i flertal af en cellepopulation af interesse med minimal indvirkning på cellemorfologi. Under sådanne betingelser, kan vi også opnå høj effektivitet knockdown af endogent protein-ekspression (> 75%). Vi beskriver hermed den metode trin for trin og bevise, at protein homeostase ikke væsentligt forstyrres som vurderet af de uændrede niveauer af stress-induceret chaperones af Heat Shock Protein familie, hvilket gør metoden velegnet til funktionelle analyser af den fysiologiske role af molekylære chaperoner efter tid-lapse video mikroskopi. Protokollen er modtagelig for celle synkronisering procedurer og anvendelsen af kommercielt tilgængelige baculovira for co-ekspression af lave niveauer af fluorescerende markører, med mindst mulig gene med normale actin-baserede og spindel dynamik under mitotisk progression. Vi viser yderligere alsidighed af metoden, der gælder for "svært at transducere" mus C2C12 celler, uden nogen væsentlig indvirkning på myoblast differentiering i myorør in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskrev vi en metode muliggør udtømning-redning eksperimenter, der skal udføres, som finder anvendelse på funktionelle analyser af celle biologiske processer, der er særligt følsomme over for overekspression af proteiner, der påvirker støkiometri og dynamik protein komplekser og makromolekylære strukturer. Mitotisk celledeling er et ekstremt eksempel på fint afstemte celle morfologiske dynamik, der involverer de mest dramatiske og spektakulære ændringer i den overordnede struktur i en celle. Brug adenofe…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Canadian Institutes of Health Research (Grant no 7077), and by the Bellini Foundation and Roby Fondazione.
Materials
| C2C12 Mouse Myoblasts | ATCC | CRL-1772 | |
| Adenovirus custom design | Welgen | Custom design | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C79-500 | |
| CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher | C10582 | |
| CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher | C10614 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), High Glucose | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher | 12483-020 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Glass bottom dishes, 35mm | MatTek Corperation | P35G-1.5-20-C Case | |
| HeLa-RFP-H2B | Kind gift of Dr Sabine Elowe, Québec, Canada | Klebig C et al. 2009 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | |
| Horse Serum, New Zealand | Thermo Fisher | 16050-122 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher | 13778-150 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha | Wisent | 310-101-CL | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Desoxyribonuleosides/Ribonucleosides | Thermo Fisher | 12000-022 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Phenol Red | Thermo Fisher | 41061-029 | |
| Na2HPO4 | Biobasic | S0404 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| OptiMEM | Thermo Fisher | 11058-021 | |
| rAVCMV-LifeAct-TagGFP2 | IBIDI | 60121 | |
| siRNA duplexes | Dharmacon | Custom design | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Trypsine 2.5% | Thermo Fisher | 15090-046 |
References
- Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Boettcher, M., McManus, M. T. Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR. Mol Cell. 58 (4), 575-585 (2015).
- Natarajan, K., Rajala, M. S., Chodosh, J. Corneal IL-8 expression following adenovirus infection is mediated by c-Src activation in human corneal fibroblasts. J Immunol. 170 (12), 6234-6243 (2003).
- Yousuf, M. A., et al. Caveolin-1 associated adenovirus entry into human corneal cells. PLoS One. 8 (10), e77462 (2013).
- Morton, P. E., Hicks, A., Nastos, T., Santis, G., Parsons, M. CAR regulates epithelial cell junction stability through control of E-cadherin trafficking. Sci Rep. 3, 2889 (2013).
- Carra, S., Seguin, S. J., Lambert, H., Landry, J. HspB8 chaperone activity toward poly(Q)-containing proteins depends on its association with Bag3, a stimulator of macroautophagy. J Biol Chem. 283 (3), 1437-1444 (2008).
- Fuchs, M., et al. Identification of the key structural motifs involved in HspB8/HspB6-Bag3 interaction. Biochem J. 425 (1), 245-255 (2010).
- Rosati, A., Graziano, V., De Laurenzi, V., Pascale, M., Turco, M. C. BAG3: a multifaceted protein that regulates major cell pathways. Cell Death Dis. 2, e141 (2011).
- Guilbert, S. M., Tanguay, R. M., Hightower, L. E., et al. . The Big Book of Small Heat Shock Proteins. , 435-456 (2015).
- Fasbender, A., et al. Complexes of adenovirus with polycationic polymers and cationic lipids increase the efficiency of gene transfer in vitro and in vivo. J Biol Chem. 272 (10), 6479-6489 (1997).
- Toyoda, K., et al. Cationic polymer and lipids enhance adenovirus-mediated gene transfer to rabbit carotid artery. Stroke. 29 (10), 2181-2188 (1998).
- Fasbender, A., et al. Incorporation of adenovirus in calcium phosphate precipitates enhances gene transfer to airway epithelia in vitro and in vivo. J Clin Invest. 102 (1), 184-193 (1998).
- Fuchs, M., et al. A Role for the Chaperone Complex BAG3-HSPB8 in Actin Dynamics, Spindle Orientation and Proper Chromosome Segregation during Mitosis. PLoS Genetics. 11 (10), e1005582 (2015).
- Champagne, C., Landry, M. C., Gingras, M. C., Lavoie, J. N. Activation of adenovirus type 2 early region 4 ORF4 cytoplasmic death function by direct binding to Src kinase domain. J Biol Chem. 279 (24), 25905-25915 (2004).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Takahashi, A., et al. Myogenic Akt signaling regulates blood vessel recruitment during myofiber growth. Mol Cell Biol. 22 (13), 4803-4814 (2002).
- Murray, T. V., et al. A non-apoptotic role for caspase-9 in muscle differentiation. J Cell Sci. 121 (Pt 22), 3786-3793 (2008).
- Terada, K., Misao, S., Katase, N., Nishimatsu, S., Nohno, T. Interaction of Wnt Signaling with BMP/Smad Signaling during the Transition from Cell Proliferation to Myogenic Differentiation in Mouse Myoblast-Derived Cells). Int J Cell Biol. 2013, 616294 (2013).
- Hindi, S. M., Tajrishi, M. M., Kumar, A. Signaling mechanisms in mammalian myoblast fusion. Sci Signal. 6 (272), re2 (2013).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
