Adenofection: En metod för att studera rollen av Molecular Följeslagare i Cellular morfodynamiska av Depletion-Räddnings Experiment
Summary
We describe a method for depletion-rescue experiments that preserves cellular integrity and protein homeostasis. Adenofection enables functional analyses of proteins within biological processes that rely on finely tuned actin-based dynamics, such as mitotic cell division and myogenesis, at the single-cell level.
Abstract
Cellulära processer såsom mitos och celldifferentiering styrs av förändringar i cellform som till stor del är beroende av korrekt ombyggnad av cell cytoskelettala strukturer. Detta involverar montering-demontering av högre ordningens makromolekylära strukturer vid en given tidpunkt och plats, en process som är särskilt känslig för störningar som orsakas av överexpression av proteiner. Metoder som kan bevara protein homeostas och upprätthåller nära-till-normal cellulär morfologi är mycket önskvärda för att bestämma den funktionella bidraget av ett protein av intresse i en rad olika cellulära processer. Gående utarmning-räddningsförsök baserade på RNA-interferens är kraftfulla metoder för att analysera proteinfunktioner och strukturella krav. Emellertid är återinförande av målproteinet med minimal avvikelse från dess fysiologiska nivå en verklig utmaning. Här beskriver vi en metod som går under benämningen adenofection som utvecklades för att studera betydelsen av molekylära chaperoner end partners i den normala driften av delande celler och relationen med aktin ombyggnad. HeLa-celler utarmat av BAG3 med siRNA duplex inriktning 3'UTR regionen. GFP-märkta BAG3 proteiner återinfördes samtidigt i> 75% av cellerna med hjälp av rekombinanta adenovirus är kopplade till transfektionsreagens. Adenofection aktiverat för att uttrycka BAG3-GFP-proteiner vid nära fysiologiska nivåer i HeLa-celler utarmade på BAG3, i frånvaro av en stressrespons. Ingen effekt observerades på nivåerna av endogena värmechockprotein följeslagare, de viktigaste stressinducerbara regulatorer av protein homeostas. Vidare genom att tillsätta baculovirus som driver uttrycket av fluorescerande markörer vid tidpunkten för cell transduktion-transfektion, kunde vi dissekera mitotiska celldynamik genom tidsförlopp mikroskopiska analyser med minimal störning av normal mitotisk progression. Adenofection är tillämpbar även på svåra att infektera musceller, och lämpar sig för funktionella analyser av myoblast differentiation in myotuber. Således adenofection ger en mångsidig metod för att utföra strukturfunktionsanalyser av proteiner involverade i känsliga biologiska processer som är beroende av högre ordning cytoskelettala dynamik.
Introduction
Funktionell inaktivering av genuttryck i däggdjursceller är den gyllene standarden för att dissekera proteinfunktioner. Nyutvecklade teknologier genomet redigering baserad på användningen av platsspecifika nukleaser såsom zink-finger nukleaser och klustrade regelbundet mellanrum korta palindromiska upprepningar (crispr) / CAS9 nu tillåta generering av cellinjer med riktade gendeletion och mutation 1,2. Dessa nya metoder ska revolutionera sättet vi studerar proteiners funktion och vår förståelse av genetiken av mänskliga sjukdomar. I vissa fall är dock inte önskvärd på lång sikt eller fullständiga genen knockout och kan framkalla sekundära mekanismer cell ersättning. Generering av genetiskt modifierade cellinjer kan också vara begränsande när det handlar om primära cellkulturer med begränsad proliferationskapacitet eller när screening av ett stort antal mutationer i olika celltyper söks. Detta är ofta ett krav för bestämning av beroendet av en cell biological process på strukturella kraven för ett protein. För detta ändamål är fortfarande reversibel knockdown av RNA-interferens som möjliggör övergående utarmning-räddningsexperiment i olika cellulära bakgrunder en enkel och kraftfull metod för att utföra strukturfunktionsanalyser av ett protein av intresse 3. Emellertid en stor nackdel med detta tillvägagångssätt är att det är svårt att uppnå en effektiv ljuddämpning och för att återinföra det intressanta proteinet eller dess varianter vid nära fysiologiska nivåer i en majoritet av cellpopulationen. Detta är avgörande för att möjliggöra omfattande studier som försöker korrelera funktionella effekter ses på nivån för enskilda celler (hypomorphic fenotyp) med de som ses i cellpopulationsbaserade analyser, till exempel på protein-proteininteraktioner.
Använda klassiska transfektion metoder, kan man knappast uppnå homogen och låg expression av exogena proteiner i en stor population av celler. Transduktion av celler med rekombinanta virussom adenovirus ofta ger mer normaliserad uttryck av exogena proteiner. Ändå är adenovirus upptag begränsas av CAR-receptorn, vilket är frånvarande i icke-humana celler eller bara svagt uttryckt i vissa humana celltyper. Dessutom aktiverar cellulära inträde av adenovirus signalvägar som reglerar cellens form och vidhäftning 4-6. Detta är naturligtvis inte önskvärt när man studerar regleringsmekanismer av cell morfodynamiska. Vi stod inför denna problematiska när vi genomförde funktionella analyser av ett förkläde komplex, BAG3-HSPB8 i celldelning och aktin dynamik. Banbrytande arbete hade beskrivit en roll för denna chaperone komplex i protein kvalitetskontroll och autophagy vid stress 7,8. De flesta av dessa studier har dock åberopat proteinuttryck, förutsatt att kaperoner normalt uppregleras under stress. Detta har lämnat frågan öppen om BAG3, i komplex med HSPB8 kan bidra till den normala driften av delande celler som uttrycker thESE chaperones som många cancercelltyper 9. I synnerhet om chaperone komplexet bidrar till ombyggnad av aktin baserade strukturer som styr mitotiska progression var av stort intresse, med tanke på de nya förbindelserna mellan hspB chaperoner och cytoskelettala dynamik 10. För att lösa detta problem, vi försöker utveckla en effektiv metod för utarmning-räddningsförsök som inte skulle störa mitotiska progression eller cellulär morfologi, och som skulle bevara protein homeostas att undvika sekundär störning av dynamiken i makromolekylära komplex som reglerar cellformförändringar . Således helst bör utföras utarmning-add-back av genen av intresse samtidigt.
Användningen av komplex av adenovirus med en katjonisk polymer eller lipider har beskrivits för att främja genöverföring in vitro och in vivo 11,12. Exempelvis verkar kalciumfosfat (Capi) för att bilda en fällning medadenovirus som förbättrar virusbindning-post via en CAR-oberoende väg 13. I själva verket fann vi att kombinera adenovirus-baserade cell transduktion och transfektion med katjoniska föreningar skulle kunna förbättra effektiviteten i utarmning-räddningsförsök. Detta tillät oss att sänka mängderna av virus genom 3- till 20-faldigt, beroende på cellinjen och genen av intresse, och dra nytta av ett bredare fönster i syfte att justera expressionen av exogena proteiner vid nära endogena nivåer i de flesta av en cellpopulation av intresse med minimal påverkan på cellulär morfologi. Under sådana förhållanden kan vi också uppnå hög effektivitet knockdown av endogena proteinuttryck (> 75%). Vi beskriver härmed metoden steg för steg och ger bevis för att protein homeostas inte signifikant störs som bedöms av de oförändrade nivåer av stressframkallade chaperones av Heat Shock Protein familj, vilket gör metoden lämplig för funktionella analyser av fysiologiska role av molekylära chaperoner efter time-lapse video mikroskopi. Protokollet är mottaglig för synkroniseringscell förfaranden och användning av kommersiellt tillgängliga baculovirus för samexpression av låga nivåer av fluorescerande markörer, med minsta möjliga störning med normal aktin baserade och spindeldynamik under mitotisk progression. Vi visar vidare mångsidigheten hos metoden, som är tillämplig på "svårt att omvandla" mus C2C12-celler, utan någon signifikant inverkan på myoblast differentiering till myotuber in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskrev vi en metod som gör det möjligt utarmning-räddningsförsök som skall utföras, som är tillämplig på funktionella analyser av cellbiologiska processer som är särskilt känsliga för överuttryck av proteiner som påverkar stökiometrin och dynamik proteinkomplex och makromolekylära strukturer. Mitotisk celldelning är ett extremt exempel på finstämda morfodynamiska cell som innebär de mest dramatiska och spektakulära förändringar i den övergripande strukturen i en cell. Använda adenofection…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Canadian Institutes of Health Research (Grant no 7077), and by the Bellini Foundation and Roby Fondazione.
Materials
| C2C12 Mouse Myoblasts | ATCC | CRL-1772 | |
| Adenovirus custom design | Welgen | Custom design | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C79-500 | |
| CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher | C10582 | |
| CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher | C10614 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), High Glucose | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher | 12483-020 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Glass bottom dishes, 35mm | MatTek Corperation | P35G-1.5-20-C Case | |
| HeLa-RFP-H2B | Kind gift of Dr Sabine Elowe, Québec, Canada | Klebig C et al. 2009 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | |
| Horse Serum, New Zealand | Thermo Fisher | 16050-122 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher | 13778-150 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha | Wisent | 310-101-CL | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Desoxyribonuleosides/Ribonucleosides | Thermo Fisher | 12000-022 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Phenol Red | Thermo Fisher | 41061-029 | |
| Na2HPO4 | Biobasic | S0404 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| OptiMEM | Thermo Fisher | 11058-021 | |
| rAVCMV-LifeAct-TagGFP2 | IBIDI | 60121 | |
| siRNA duplexes | Dharmacon | Custom design | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Trypsine 2.5% | Thermo Fisher | 15090-046 |
References
- Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Boettcher, M., McManus, M. T. Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR. Mol Cell. 58 (4), 575-585 (2015).
- Natarajan, K., Rajala, M. S., Chodosh, J. Corneal IL-8 expression following adenovirus infection is mediated by c-Src activation in human corneal fibroblasts. J Immunol. 170 (12), 6234-6243 (2003).
- Yousuf, M. A., et al. Caveolin-1 associated adenovirus entry into human corneal cells. PLoS One. 8 (10), e77462 (2013).
- Morton, P. E., Hicks, A., Nastos, T., Santis, G., Parsons, M. CAR regulates epithelial cell junction stability through control of E-cadherin trafficking. Sci Rep. 3, 2889 (2013).
- Carra, S., Seguin, S. J., Lambert, H., Landry, J. HspB8 chaperone activity toward poly(Q)-containing proteins depends on its association with Bag3, a stimulator of macroautophagy. J Biol Chem. 283 (3), 1437-1444 (2008).
- Fuchs, M., et al. Identification of the key structural motifs involved in HspB8/HspB6-Bag3 interaction. Biochem J. 425 (1), 245-255 (2010).
- Rosati, A., Graziano, V., De Laurenzi, V., Pascale, M., Turco, M. C. BAG3: a multifaceted protein that regulates major cell pathways. Cell Death Dis. 2, e141 (2011).
- Guilbert, S. M., Tanguay, R. M., Hightower, L. E., et al. . The Big Book of Small Heat Shock Proteins. , 435-456 (2015).
- Fasbender, A., et al. Complexes of adenovirus with polycationic polymers and cationic lipids increase the efficiency of gene transfer in vitro and in vivo. J Biol Chem. 272 (10), 6479-6489 (1997).
- Toyoda, K., et al. Cationic polymer and lipids enhance adenovirus-mediated gene transfer to rabbit carotid artery. Stroke. 29 (10), 2181-2188 (1998).
- Fasbender, A., et al. Incorporation of adenovirus in calcium phosphate precipitates enhances gene transfer to airway epithelia in vitro and in vivo. J Clin Invest. 102 (1), 184-193 (1998).
- Fuchs, M., et al. A Role for the Chaperone Complex BAG3-HSPB8 in Actin Dynamics, Spindle Orientation and Proper Chromosome Segregation during Mitosis. PLoS Genetics. 11 (10), e1005582 (2015).
- Champagne, C., Landry, M. C., Gingras, M. C., Lavoie, J. N. Activation of adenovirus type 2 early region 4 ORF4 cytoplasmic death function by direct binding to Src kinase domain. J Biol Chem. 279 (24), 25905-25915 (2004).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Takahashi, A., et al. Myogenic Akt signaling regulates blood vessel recruitment during myofiber growth. Mol Cell Biol. 22 (13), 4803-4814 (2002).
- Murray, T. V., et al. A non-apoptotic role for caspase-9 in muscle differentiation. J Cell Sci. 121 (Pt 22), 3786-3793 (2008).
- Terada, K., Misao, S., Katase, N., Nishimatsu, S., Nohno, T. Interaction of Wnt Signaling with BMP/Smad Signaling during the Transition from Cell Proliferation to Myogenic Differentiation in Mouse Myoblast-Derived Cells). Int J Cell Biol. 2013, 616294 (2013).
- Hindi, S. M., Tajrishi, M. M., Kumar, A. Signaling mechanisms in mammalian myoblast fusion. Sci Signal. 6 (272), re2 (2013).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
