Herstellung von CD4<sup> +</sup> T-Zellen für die Analyse von GD3 und GD2 Gangliosid Membran-Expression durch Mikroskopie
Summary
Wir beschreiben einen Standardantikörperfärbung Protokoll für den Einsatz in der Mikroskopie , die Membran Expression und Lokalisation von Gangliosiden in ruhenden und aktivierten humanen naiven CD4 + T – Zellen zu bestimmen. mit <40.000 Zellen sind auch Echtzeit-PCR-Experimente beschrieben, die keine zusätzlichen Low-Input-RNA-Kits erfordern.
Abstract
Die hierin beschriebenen Verfahren zur Aktivierung von naiven CD4 + T – Zellen in Suspension und deren Einhaltung in Deck für die konfokale Mikroskopie Analyse ermöglichen die räumliche Lokalisierung und Visualisierung von Gangliosiden in CD4 + T – Zellaktivierung beteiligt, dass Komplement expression profiling Experimente wie Durchflusszytometrie, Western Blotting oder real-time PCR. Die Quantifizierung von Gangliosid Expression durch Durchflusscytometrie und ihre zelluläre Lokalisation durch Mikroskopie kann durch die Verwendung von anti-Gangliosid-Antikörper mit hoher Affinität und Spezifität erhalten werden. Dennoch beinhaltet eine angemessene Handhabung von Zellen in Suspension die Behandlung von Kulturplatten die notwendige Haftung für Fluoreszenz oder konfokalen Mikroskopie Erwerb erforderlich zu fördern. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll zur Bestimmung GD3 und GD2 Gangliosidexpression und Kolokalisation mit dem TCR bei naiven CD4 + T – Zell – Aktivierung. Auch Real-time PCR Experimente <40.000 Zellen verwendet werden für die Bestimmung des GD3 und GM2 / GD2-Synthase-Gene beschrieben, kann das Gen-Analyse-Experimente zeigen, mit einer geringen Anzahl von Zellen und ohne die Notwendigkeit von zusätzlichen niedrigen Eingangs RNA Kits durchgeführt werden.
Introduction
Die CD4 + T – Zellen dirigieren , die Immunantwort durch ihre Effektorfunktionen nach Aktivierung durch Antigen – präsentierende Zellen 1. Die Untersuchung der zellulären Mechanismen, die während der Aktivierung moduliert werden können Einblick in eine grundlegende Prozess der Immunfunktion. Jedoch kann die Studie von naiven CD4 + T – Zellen kompliziert sein , weil sie eine sehr kleine Population von Zellen im Blut Peripherie 2 darstellen.
Durch Fluoreszenzmikroskopie Mehrere Berichte haben die Lokalisierung verschiedener Moleküle beteiligt in CD4 + T – Zell – Aktivierung untersucht, vor allem Proteine an die Plasmamembran 3 verbunden. Die Ganglioside sind Sialinsäure Glycosphingolipide und obwohl sie in Nervenzellen intensiv untersucht worden , wo sie reichlich vorhanden, andere Zellen, wie Immunzellen sind auch ausdrücken Ganglioside mit biologisch relevanten Funktionen 4,5. Wir berichteten bereits that während der Aktivierung des menschlichen naiven CD4 + T – Zellen gibt es eine Aufregulation der α2,8 Sialyltransferase ST8Sia 1 (GD3 – Synthase) und die GM2 / GD2 – Synthase, dass die signifikante Oberflächen neoexpression von GD2 induzieren und die Hochregulation von GD3 Gangliosid 6. Weitere Studien von GD3, GD2 und andere Ganglioside in Immunzellen notwendig ist, ein Protein-basierte Teilansicht der Immunfunktion zu ergänzen.
Üblicherweise wird die Untersuchung von Gangliosid – Expression auf Techniken wie Dünnschichtchromatographie (TLC) 7 basiert, aber diese Technik die räumliche Lokalisierung von Gangliosiden an der Plasmamembran oder in subzellulären Kompartimenten nicht erlaubt, biologische Analyse begrenzen.
In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll für die Antikörper-vermittelte Identifizierung und Lokalisierung von GD3 und GD2 – Ganglioside in der menschlichen naiven CD4 + T – Zellen und PBMCs nach anti-CD3 / anti-CD28 – Aktivierung. Mit diesem Protokoll es is auch möglich , das Gen und molekularen Expression von Gangliosiden in einer geringen Anzahl von Zellen in Suspension mit dem Erwerb von Bildern hoher Qualität 6, unter Berücksichtigung der geringen Größe von Lymphozyten (9 & mgr; m) zu analysieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das beschriebene Protokoll kann verwendet werden , Ganglioside oder Proteine in Zellsuspensionen von CD4 + T – Zellen oder andere Immunzellen (zB PMBCs, 5) aus einer kleinen Anzahl von Zellen ausgehend zu lokalisieren. Aufgrund der geringen Größe von T-Zellen und nicht-haftenden Eigenschaften, den Erwerb von fluoreszenzmikroskopische Bilder führt zu einer schlechten Informationen oder niedriger Qualität, wenn die Zellen nicht richtig eingehalten werden.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Dr. José Luis Daniotti for comments. We thank the assistance to Dr. J. Arturo Pimentel and the Laboratorio Nacional de Microscopìa Avanzada-UNAM for acquisition of confocal images. I.M.-D. and T.M.V.C. were supported by grants 157634 and 253596 from Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologìa (CONACYT), Sociedad Latinoamericana de Glicobiologìa, A.C. T.M.V.-C. is recipient of a scholarship (245192) from CONACYT. We also thank the support of the Red Temática Glicociencia en Salud – CONACYT (253596).
Materials
| Advanced RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 12633-012 | Suplemented with 3% FBS |
| mouse anti human CD3 antibody | eBioscience | 16-0037-81 | OKT3 clone |
| mouse anti human CD28 antibody | ebioscience | 16-0288-81 | CD28.6 clone |
| mouse anti human GD3 antibody | Abcam | ab11779 | R24 clone |
| mouse anti human GD2 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53831 | 14G2a clone |
| FITC-conjugated anti-mouse IgG3 antibody |
Abcam | ab97259 | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21131 | |
| IgG2a antibody | |||
| Alexa Fluor 647 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21241 | |
| IgG2a antibody | |||
| Hoechst 333258 | Sigma-Aldrich | 861405 | |
| Ficoll Paque-Plus | GE | 17-1440-02 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | |
| Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human | MACS Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | Sorting | |
| Nunc Lab-tek chamber slide system | Sigma-Aldrich | C7182 | |
| Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus) | Olympus | Upright BX61WI and IX81 | |
| Forward sequence primer GD3 synthase | 5´-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GD3 synthase | 5´-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3´ | Ref. 7 | |
| Forward sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´ | Ref. 7 |
References
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