Mesure de<em> In vitro</em> Activité d'intégration du VIH-1 préintégration Complexes

Summary

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Abstract

les protéines d'enveloppe du VIH-1 engagent récepteurs correspondants sur la surface de la cellule cible, ce qui conduit à la cellule d'origine virale fusion membranaire, suivie par la libération du noyau capside (CA) dans le cytoplasme. Par la suite, le virus de la transcriptase inverse (RT), dans le cadre d'un complexe du même nom nucléoprotéine appelée Reverse Transcription Complex (RTC), convertit le génome d'ARN simple brin viral dans une copie d'ADN double brin (vDNA). Cela conduit à la biogenèse d'un autre complexe de nucléoprotéine, appelé le complexe de pré-intégration (PIC), composée de la vDNA et des protéines virales associées et les facteurs de l'hôte. L'intégrase virale PIC-associé (IN) orchestrant l'intégration du vDNA dans l'ADN chromosomique de l'hôte dans un processus en deux étapes régulé temporellement et spatialement. D'abord, le processus IN extrémités 3 'du vDNA dans le cytoplasme et, en second lieu, après que le PIC trafique vers le noyau, il médie l'intégration du vDNA transformé dans l'ADN chromosomique. Les PICs isolésà partir de cellules cibles infectées de façon aiguë par le VIH-1 sont fonctionnelles in vitro, car ils sont compétents pour intégrer la vDNA associée à un ADN cible hétérologue ajouté de manière exogène. Dans des tests d'intégration in vitro telle base PIC ont considérablement contribué à délimiter les détails mécanistiques de l' intégration rétrovirale et à la découverte de inhibiteurs de l' IN. Dans ce rapport, nous élaborons sur un VIH-1 PIC test mis à jour qui utilise un imbriquée en temps réel Polymerase Chain Reaction quantitative (qPCR) stratégie à base de mesure de l'activité d'intégration in vitro de PICs indigènes isolés.

Introduction

HIV-1 replication dans la cellule cible implique plusieurs étapes, de façon générale regroupées en deux phases: les événements précoces et tardifs. Les événements précoces commencent lorsque le VIH-1 de façon séquentielle se lie au récepteur de surface des cellules cibles CD4 et l' un des deux co-récepteurs (CCR5 ou CXCR4) ^1. Par conséquent, la membrane fusible virus des cellules, et la capside virale (CA) de base est libérée dans le cytoplasme ^2. Le noyau CA contient l'ARN viral génomique simple brin (ssRNA) et plusieurs protéines, à la fois virale et cellulaire à l'origine. Les protéines virales associées CA comprennent la transcriptase inverse (RT) et intégrase (IN), deux enzymes qui interviennent dans les étapes critiques pendant les événements précoces de la réplication virale. La RT et IN fonction dans le contexte des complexes de nucléoprotéine, à savoir la transcription inverse complexe (RTC) et le complexe de pré-intégration (PIC), respectivement ^{3, 4, 5} <sup>, ^6. Les extrémités du génome viral de ssRNA terminal portuaire répétition (R) des éléments adjacents aux séquences U5 uniques (à l'extrémité 5 ') et U3 (à l'extrémité 3'). Le RTC convertit le ssRNA génome viral dans un (ds) copie d'ADN double brin (vDNA). Ce processus de transcription inverse se traduit également par une duplication des séquences U3 et U5, générant ainsi des longues répétitions terminales (LTR) aux deux extrémités de la vDNA ^{7, 8.} Par la suite, IN PIC associé catalyse deux réactions biochimiques successives qui permettent l'intégration du vDNA dans le chromosome hôte ^{9, 10, 11.} Tout d' abord, dans le cytoplasme, IN multimères s'engager les deux LTR et ¹² cliver un dinucléotide à partir de chacune des extrémités 3 'terminales. Ce traitement génère l' extrémité 3 ' d' un groupe hydroxyle à chaque extrémité 3' _(OH CA) de la vDNA.Ensuite, PIC trafique vers le noyau, dans lequel IN utilise le vDNA CA _OH comme nucléophile pour couper les deux brins de l'ADN chromosomique en quinconce. Simultanément, se dissocie de façon coordonnée les deux extrémités du vDNA aux liaisons phosphodiester résultant sur des brins opposés de l'ADN chromosomique. Après cette étape de transfert de brin, la machinerie de la cellule hôte supprime les deux nucléotides non appariés aux extrémités 5 'de la vDNA et répare les lacunes simple brin qui en découlent à la jonction du site d'intégration. Les événements précoces aboutissent donc à la création d'une copie d'ADN intégré (provirus) du génome du VIH-1. Provirus fournit un environnement approprié pour l'expression des gènes viraux efficaces, ce qui déclenche des événements ultérieurs, y compris l'expression des protéines codées par le virus; assemblage du virus immature; et le bourgeonnement, la libération et la maturation dans des virions infectieux ^13.

Purifié rétroviral IN recombinant est compétent pourréaliser, in vitro, les deux traitement et de transfert de brin activités 3'-terminales sur exogène ADN substrat LTR-like. Des études biochimiques utilisant de tels recombinant purifié IN ont révélé des aspects critiques de l' intégration vDNA ^{14, 15, 16, 17.} Cependant, contrairement à une infection naturelle, cette réaction biochimique in vitro ne supporte pas l' intégration concertée des deux extrémités de l'ADN de substrat dans l'ADN cible. En revanche, les PIP rétrovirales isolées à partir de cellules infectées de façon aiguë intégration concertée des deux extrémités du vDNA endogène dans un ADN cible hétérologue. Cela a conduit à l'adoption généralisée et des améliorations ultérieures de Vitro Intégration (IVI) essais I n en utilisant PICs indigènes isolés.

Dans le premier essai rapporté IVI rétroviraux, des extraits cytoplasmiques provenant de cellules infectées par un recombinant murineVirus de la Leucémie (MLV) hébergeant le gène de E. coli SupF dans sa LTR a servi comme source d'activité IN et l'ADN d'un mutant de phage lambda défectueux dans la croissance lytique a été fourni de manière exogène comme l'ADN cible. l'intégration réussie de l'ADN recombinant MLV la copie dans l'ADN du phage et l'expression qui suit SupF conduit à la restauration de la capacité des phages recombinants de formation de plaques. Cependant, cette stratégie expérimentale est laborieuse et l'intégration de mesures d'une manière indirecte. Pour faire face à ces mises en garde, un test de fin marquage indirect basé blot-Sud, qui quantifie l'activité IVI PIC associée en tant que mesure de la vDNA endogène intégré dans bactériophage linéarisé exogène phiX174 ADN, a été mis au point ^{6, 7, 18.} Bien que cette méthode fournit une mesure directe des événements d'intégration, des quantités relativement élevées de la préparation des PIC sont nécessaires, ce qui reste un défi techniqueeffort. Pour contourner cela, des tests basés sur la PCR imbriquées ne nécessitant que des quantités modestes de PICs ont été développés ^{4, 5, 19.}

Dans ce rapport, nous décrivons une version mise à jour d'une PCR nichée à base in vitro conçu pour récapituler l'activité d'intégration du VIH-1 PIC médiée survenant au cours de l' infection naturelle. Cette méthode utilise les extraits cytoplasmiques des cellules cibles du VIH-1 infectées en tant que source d'activité PIC endogène, qui est mesurée à l'aide d'une polymérase en temps réel quantitative Chain Reaction (PCR quantitative). Les procédures d'isolement PICs et mesurer leurs activités d'intégration sont adaptées, avec des modifications, des protocoles publiés par le laboratoire Engelman ^20. Dans ce procédé, l'activité d'intégration PIC associée est déclenchée en fournissant un ADN cible exogène linéaire ^21, et les produits d'ADN résultant decette réaction d'intégration sont purifiés et utilisés comme matière de départ pour la quantification par PCR ultérieure. Dans le premier tour de PCR classique, les jonctions d'ADN viral cible sont amplifiés en utilisant des amorces appropriées. Dans le second tour qPCR, amorces LTR-spécifiques sont utilisés pour enrichir spécifiquement la population vDNA des produits de première ronde de PCR. S'il vous plaît voir la section de protocole pour une description détaillée de cette méthode.

Des études in vitro avec PICs rétroviraux ont permis des avancées significatives dans notre compréhension du mécanisme d'intégration de l' ADN rétroviral et dans le développement d'inhibiteurs IN. Sur la base de la récente focalisation accrue sur la cartographie du VIH-1 des sites d'intégration, déterminer le rôle des facteurs viraux et d'accueil du VIH-1 l'intégration et le développement de nouveaux médicaments antiviraux dans la lutte contre la résistance aux médicaments, nous envisageons un intérêt accru et l'utilisation généralisée des IVI essais , comme celle décrite dans le présent rapport. Ceci, à son tour, conduira àaméliorations futures dans la méthode, diversifiant ainsi la portée de ses applications.

Protocol

1. Production de virus Remarque: pour produire des titres élevés de VIH-1 infectieux, transfecter la lignée de rein embryonnaire humain (HEK), des cellules 293T avec un HIV-1 clone moléculaire infectieux en utilisant un réactif de transfection à base de dendrimères activés. Il a été observé que le procédé au phosphate de calcium de transfection donne des résultats comparables. Dans un niveau de biosécurité 2 (NSB2) laboratoire, graines 3 x 10 6 cellules …

Representative Results

Isolement du VIH-1 PICs Un schéma du protocole utilisé pour l'isolement du HIV-1 provenant de cellules PIP Sup-T1 infection aiguë est représenté sur la figure 1. Ce protocole est dérivé des méthodes décrites par Engelman et al. 19, 20. VIH-1 PICs sont complexes nucléoprotéine qui sont assemblés dans des cellule…

Discussion

Les analyses biochimiques de PICs rétrovirales ont fourni des informations critiques dans le mécanisme de l'intégration de l'ADN rétroviral. La mesure de l'activité d'intégration des PIC rétroviraux peut être obtenue par un essai de formation de plaque, l'analyse par transfert de Southern et emboîtée qPCR. La stratégie expérimentale de l' essai sur plaque est laborieuse et utilise une méthode indirecte pour mesurer l' intégration ^6, <sup class=…

Materials

Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO/Invitrogen	10437-028
Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS)	GIBCO/Invitrogen	10438-026
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	GIBCO/Invitrogen	11995-065
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	GIBCO/Invitrogen	11875-093
Phosphate buffered saline (PBS) (1X)	GIBCO/Invitrogen	20012-027
Trypsin-EDTA (0.25%)	GIBCO/Invitrogen	25200-056
Penicillin-Streptomycin solution (100x)	Cellgro/Mediatech	30-002-CI
HEK293T cells (293T)	American Type Culture Collection (ATCC)	CRL-3216
HIV-1 proviral molecular clone pNL4-3	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	114
PolyFect transfection reagent	Qiagen	301107
DNase	Calbiochem/Merckmillipore	260913
Immulon 2HB 96-well plates	Thermo Scientific	3455
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
ELISA coating antibody: anti-CA-183-H12-5C monoclonal antibody	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	1513
ELISA wash solution (0.2% Tween-20 in PBS)	—	—
Donor bovine serum	Gibco/Invitrogen	16030074
Blocking Buffer (5% donor bovine serum in PBS) – Prepare fresh before use.	—	—
Sample diluent (SD) buffer (10% donor bovine serum and 0.5% Triton X-100 in PBS) – Sterilize using 0.22 micron pore-size syringe filter and store aliquots at 4°C.	—	—
Recombinant p24 protein (Full-length CA protein was expressed from pET21a-CA plasmid in E. coli BL21-DE3 and purified as described in Ref # —-)	Dr. Wesley Sundquist	—
HIV IgG	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	3957
Goat anti-human IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, HRP conjugate	Pierce/ThermoFisher	31412
TMB Microwell Peroxidase substrate system	KPL, Inc.	50-76-00
SupT1 cells	American Type Culture Collection (ATCC)	CRL-1942
HEPES pH 7.2-7.5 (ready-to-use solution)	GIBCO/Invitrogen	15630-080
Potassium chloride (KCl) solution	Sigma-Aldrich	60142
Magnesium chloride (MgCl2) solution	Sigma-Aldrich	M1028
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815
Aprotinin	Sigma-Aldrich	A6106
Digitonin	Sigma-Aldrich	D141
RNase A	Invitrogen	12091-021
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
phiX174 Replicative Form 1 DNA	Promega	D1531
PhiX174-F primer: 5’-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3’ PhiX174-R primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’	Invitrogen and/or IDT-DNA
dNTP mix	Promega	U1515
Go Taq DNA Polymerase	Promega	M3005
Qiaquick gel extraction kit	Qiagen	28706
Ultrapure distilled water	Invitrogen	10977-015
Tris-EDTA (TE) buffer (100X)	Sigma-Aldrich	T9285
Sodium dodecyl sulphate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0	Sigma-Aldrich	E7889
Proteinase K (20 mg/ml ready-to-use solution)	Qiagen	19131
Phenol (equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0 and 1 mM EDTA)	Sigma-Aldrich	P4557
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
Glycogen (5 mg/ml solution)	Ambion/Invitrogen	AM9510
Sodium acetate (3M, pH 5.2)	Sigma-Aldrich	57899
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
First round LTR primer: 5’-GTGCGCGCTTCAGCAAG-3’) First round phiX174 primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’	Invitrogen and/or IDT-DNA	—
Second round LTR-R primer: 5’-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3’ Second round LTR-U primer: 5’-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3’; Second round Taqman probe:  5’-56– FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC CTTGAGTGC/36-TAMRA/-3’	Invitrogen and/or IDT-DNA	—
iQ Supermix	Bio-Rad	170-8862