Medida de<em> In Vitro</em> Integración Actividad del VIH-1 preintegration Complejos

Summary

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Abstract

proteínas del VIH-1 del sobre se involucran receptores afines en la superficie de células diana, lo que conduce a la fusión de membranas de células viral seguido por la liberación del núcleo de la cápside viral (CA) en el citoplasma. Posteriormente, el viral transcriptasa inversa (RT), como parte de un complejo de nucleoproteína homónimo denomina la transcripción inversa Complex (RTC), convierte el genoma de ARN de una sola hebra viral en una copia de ADN de doble cadena (ADNv). Esto conduce a la biogénesis de otro complejo de nucleoproteína, llamado el complejo de pre-integración (PIC), compuesto por el vDNA y proteínas del virus asociados y los factores del huésped. La integrasa viral PIC-asociado (IN) orquesta la integración del ADNv en el ADN cromosómico del huésped en un proceso de dos pasos regulado temporal y espacialmente. En primer lugar, en los procesos de la los extremos 3 'de la ADNv en el citoplasma y, segundo, después de que el PIC trafica al núcleo, que media la integración del ADNv procesado en el ADN cromosómico. Los PIC aisladosde las células diana infectadas de forma aguda con VIH-1 son funcionales in vitro, ya que son competentes para integrar el ADNv asociado en un ADN diana heterólogo añadido exógenamente. Tal integración en ensayos in vitro basados en PIC han contribuido significativamente a delinear los detalles de la mecánica de la integración retroviral y para el descubrimiento de inhibidores de la IN. En este informe, se elabora sobre un ensayo de VIH-1 PIC actualizada que emplea una estrategia basada en anidada en tiempo real de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) para medir la actividad de integración in vitro de los PIC nativas aisladas.

Introduction

VIH-1 de replicación en la célula diana implica varios pasos, en términos generales, agrupadas en dos fases: eventos tempranos y tardíos. Los primeros eventos comienzan cuando el VIH-1 secuencialmente une a la superficie de la célula diana receptor CD4 y uno de los dos co-receptores (CCR5 o CXCR4) ^1. En consecuencia, el fusible membranas virus-célula, y la cápside viral (CA) de núcleo se libera en el citoplasma ^2. El núcleo CA contiene el ARN viral genómico de cadena sencilla (ssRNA) y varias proteínas, tanto virales y celulares de origen. Las proteínas virales CA-asociados incluyen la transcriptasa inversa (RT) y la integrasa (IN), dos enzimas que median pasos críticos durante los primeros eventos en la replicación viral. El RT y EN la función en el contexto de complejos de nucleoproteína, a saber, la transcripción inversa Complex (RTC) y el complejo de pre-integración (PIC), respectivamente ^{3, 4, 5} <sup>, ^6. Los extremos del genoma viral de ARN de cadena simple terminal del puerto de repetición (R) elementos adyacentes a la U5 secuencias únicas (en el extremo 5 ') y U3 (en el extremo 3'). El RTC convierte el genoma ARN de cadena simple viral en un (ds) de copias de ADN de doble cadena (ADNv). Este proceso de transcripción inversa también da lugar a la duplicación de las secuencias U5 y U3, generando así repeticiones terminales largas (LTR) en ambos extremos de la ADNv ^{7, 8.} Posteriormente, el IN PIC-asociado cataliza dos reacciones bioquímicas secuenciales que permiten la integración de la ADNv en el cromosoma huésped ^{9, 10, 11.} En primer lugar, en el citoplasma, IN multímeros participar ambas LTRs ¹² y escindir un dinucleótido de cada uno de los extremos 3'-terminales. Este procesamiento extremo 3 'genera un grupo hidroxilo en cada extremo 3' (CA _OH) de la ADNv.A continuación, PIC trafica al núcleo, en el que en el ADNv utiliza CA _OH como nucleófilo para cortar ambas cadenas del ADN cromosómico de una manera escalonada. Simultáneamente, en empalmes coordinadamente ambos extremos del ADNv a los enlaces fosfodiéster resultantes en cadenas opuestas del ADN cromosómico. Después de esta etapa de transferencia de cadena, la maquinaria de la célula huésped elimina los dos nucleótidos no apareados en los extremos 5 'de la vDNA y reparaciones de las brechas de cadena sencilla consiguientes en la unión del sitio de integración. Así, los primeros eventos culminan con la creación de una copia de ADN integrado (provirus) del genoma del VIH-1. El provirus proporciona un entorno adecuado para la expresión génica viral eficiente, que inicia los eventos posteriores, incluyendo la expresión de las proteínas codificadas por el virus; ensamblaje del virus inmaduro; y en ciernes, la liberación y la maduración en viriones infecciosos ^13.

Retroviral recombinante purificada EN es competente parallevar a cabo, in vitro, tanto en las actividades de procesamiento y el capítulo de transferencia del extremo 3 'de ADN exógena suministrados sustrato LTR-similares. Los estudios bioquímicos utilizando dicha purificado en recombinante han puesto de manifiesto los aspectos críticos de la integración ADNv ^{14, 15, 16, 17.} Sin embargo, a diferencia de la infección natural, esta reacción bioquímica in vitro no es compatible con la integración concertada de ambos extremos del sustrato de ADN en el ADN objetivo. Por el contrario, PICs retrovirales aisladas de células infectadas de forma aguda se integran concertada ambos extremos de la ADNv endógeno en el ADN diana heterólogo. Esto condujo a la adopción generalizada y posteriores refinamientos de ensayos in vitro de Integración (IVI) E n el uso de los PIC nativas aisladas.

En la primera informado ensayo retroviral IVI, extractos citoplasmáticos de células infectadas con un recombinante murinoVirus de la leucemia (MLV) que alberga el gen E. coli supF en su LTR sirvió como la fuente de la actividad de IN, y el ADN de un fago lambda mutante defectuoso en el crecimiento lítico fue suministrado exógenamente como el ADN diana. La integración exitosa del ADN recombinante MLV copia en el ADN del fago y la consiguiente p F expresión condujo a la restauración de la capacidad formadora de placa de los fagos recombinantes. Sin embargo, esta estrategia experimental es laborioso y medidas de integración de una manera indirecta. Para hacer frente a estas advertencias, un ensayo de marcaje terminal indirecto basado en la transferencia de Southern, que cuantifica la actividad IVI PIC-asociado como una medida de la ADNv endógeno integrado en el ADN exógeno phiX174 bacteriófago linealizado, se desarrolló ^{6, 7, 18.} Aunque este método proporciona una medida directa de eventos de integración, se requieren cantidades relativamente altas de preparación PIC, que sigue siendo un desafío técnicoesfuerzo. Para evitar esto, ensayos basados en PCR anidados que requieren sólo cantidades modestas de PICs se desarrollaron ^{4, 5, 19.}

En este informe se describe una versión actualizada de una PCR anidada-basado en el método in vitro ideado para recapitular la actividad de integración mediada PIC VIH-1 se produce durante la infección natural. Este método utiliza los extractos citoplasmáticos de las células diana infectadas por VIH-1 como fuente de actividad endógena PIC, que se mide con un tiempo real de la polimerasa cuantitativa reacción en cadena (qPCR). Los procedimientos para el aislamiento de los PIC y la medición de sus actividades de integración se adaptan, con modificaciones, a partir de los protocolos publicados por el laboratorio Engelman ^20. En este método, la actividad de integración PIC-asociado se inicia proporcionando una diana de ADN exógeno lineal ^21, y los productos de ADN resultantes deesta reacción integración se purifican y se utiliza como material de partida para la cuantificación basada en la PCR subsiguiente. En la primera ronda de PCR convencional, las uniones de ADN viral diana se amplifican mediante el uso de cebadores apropiados. En la segunda ronda qPCR, cebadores LTR-específicos se utilizan para enriquecer específicamente a la población a partir de los vDNA primera ronda productos de PCR. Por favor, vea la sección de protocolo para una descripción detallada de este método.

Los estudios in vitro con PICs retrovirales han dado lugar a avances significativos en nuestra comprensión del mecanismo de integración del ADN retroviral y en el desarrollo de inhibidores de la IN. Sobre la base de la reciente mayor enfoque en la cartografía del VIH-1 sitios de integración, la determinación del papel de los factores virales y del huésped en el VIH-1 la integración y desarrollo de nuevos fármacos antivirales para combatir la resistencia a los medicamentos, prevemos un aumento del interés y el uso generalizado de los ensayos de IVI , como el descrito en este informe. Esto, a su vez, dará lugar afuturas mejoras en el método, diversificando de esta manera el alcance de sus aplicaciones.

Protocol

1. Virus de Producción NOTA: Para generar altos títulos de VIH-1 infeccioso, transfectar la línea celular de riñón embrionario humano (HEK) 293T con un clon molecular infeccioso de VIH-1 usando un reactivo de transfección a base de dendrímero activado. Se ha observado que el método de fosfato de calcio transfección produce resultados comparables. En un laboratorio de bioseguridad de nivel 2 (BSL2), semilla de 3 x 10 6 293T células por placa de 10 cm en 8 ml de…

Representative Results

Aislamiento de VIH-1 PICs Un esquema del protocolo utilizado para el aislamiento de VIH-1 fotografías de células Sup-T1 infectadas de forma aguda se representa en la Figura 1. Este protocolo se deriva de los métodos descritos por Engelman et al. 19, 20. VIH-1 PICs son complejos de nucleoproteína que se ensamblan en las cé…

Discussion

Los análisis bioquímicos de los PIC retrovirales han proporcionado ideas fundamentales sobre el mecanismo de integración del ADN retroviral. Medición de la actividad de integración de PICs retrovirales se puede lograr mediante ensayo en placa formación, análisis de transferencia Southern, y anidada qPCR. La estrategia experimental de ensayo de placas es laborioso y utiliza un método indirecto para medir la integración ^{6, 7, …}

Materials

Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO/Invitrogen	10437-028
Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS)	GIBCO/Invitrogen	10438-026
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	GIBCO/Invitrogen	11995-065
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	GIBCO/Invitrogen	11875-093
Phosphate buffered saline (PBS) (1X)	GIBCO/Invitrogen	20012-027
Trypsin-EDTA (0.25%)	GIBCO/Invitrogen	25200-056
Penicillin-Streptomycin solution (100x)	Cellgro/Mediatech	30-002-CI
HEK293T cells (293T)	American Type Culture Collection (ATCC)	CRL-3216
HIV-1 proviral molecular clone pNL4-3	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	114
PolyFect transfection reagent	Qiagen	301107
DNase	Calbiochem/Merckmillipore	260913
Immulon 2HB 96-well plates	Thermo Scientific	3455
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
ELISA coating antibody: anti-CA-183-H12-5C monoclonal antibody	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	1513
ELISA wash solution (0.2% Tween-20 in PBS)	—	—
Donor bovine serum	Gibco/Invitrogen	16030074
Blocking Buffer (5% donor bovine serum in PBS) – Prepare fresh before use.	—	—
Sample diluent (SD) buffer (10% donor bovine serum and 0.5% Triton X-100 in PBS) – Sterilize using 0.22 micron pore-size syringe filter and store aliquots at 4°C.	—	—
Recombinant p24 protein (Full-length CA protein was expressed from pET21a-CA plasmid in E. coli BL21-DE3 and purified as described in Ref # —-)	Dr. Wesley Sundquist	—
HIV IgG	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	3957
Goat anti-human IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, HRP conjugate	Pierce/ThermoFisher	31412
TMB Microwell Peroxidase substrate system	KPL, Inc.	50-76-00
SupT1 cells	American Type Culture Collection (ATCC)	CRL-1942
HEPES pH 7.2-7.5 (ready-to-use solution)	GIBCO/Invitrogen	15630-080
Potassium chloride (KCl) solution	Sigma-Aldrich	60142
Magnesium chloride (MgCl2) solution	Sigma-Aldrich	M1028
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815
Aprotinin	Sigma-Aldrich	A6106
Digitonin	Sigma-Aldrich	D141
RNase A	Invitrogen	12091-021
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
phiX174 Replicative Form 1 DNA	Promega	D1531
PhiX174-F primer: 5’-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3’ PhiX174-R primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’	Invitrogen and/or IDT-DNA
dNTP mix	Promega	U1515
Go Taq DNA Polymerase	Promega	M3005
Qiaquick gel extraction kit	Qiagen	28706
Ultrapure distilled water	Invitrogen	10977-015
Tris-EDTA (TE) buffer (100X)	Sigma-Aldrich	T9285
Sodium dodecyl sulphate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0	Sigma-Aldrich	E7889
Proteinase K (20 mg/ml ready-to-use solution)	Qiagen	19131
Phenol (equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0 and 1 mM EDTA)	Sigma-Aldrich	P4557
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
Glycogen (5 mg/ml solution)	Ambion/Invitrogen	AM9510
Sodium acetate (3M, pH 5.2)	Sigma-Aldrich	57899
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
First round LTR primer: 5’-GTGCGCGCTTCAGCAAG-3’) First round phiX174 primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’	Invitrogen and/or IDT-DNA	—
Second round LTR-R primer: 5’-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3’ Second round LTR-U primer: 5’-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3’; Second round Taqman probe:  5’-56– FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC CTTGAGTGC/36-TAMRA/-3’	Invitrogen and/or IDT-DNA	—
iQ Supermix	Bio-Rad	170-8862