mätning av<em> In Vitro</em> Integration Aktivitet av HIV-1 Preintegration Anläggningar

Summary

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Abstract

HIV-1-höljesproteiner i ingrepp besläktade receptorer på målcellens yta, vilket leder till viral-cellmembranfusion, följt av frisättning av den virala kapsiden (CA) kärnan in i cytoplasman. Därefter det virala omvänt transkriptas (RT), som en del av en namne nukleoprotein komplex kallas omvänd transkription Complex (RTC), omvandlar den virala enkelsträngat RNA-genom in i en dubbelsträngad DNA-kopia (vDNA). Detta leder till biogenes av annan nukleoprotein komplex, kallas pre-integrationskomplex (PIC), bestående av vDNA och tillhörande virusproteiner och värdfaktorer. PIC-associerad viral integras (IN) dirigerar integreringen av vDNA: t in i värdens kromosomala DNA i en temporalt och spatialt reglerat tvåstegsprocess. För det första, i processer 3'-ändarna av vDNA: t i cytoplasman och, för det andra, efter det PIC trafikerar till kärnan, medierar den integrering av det bearbetade vDNA in i kromosomalt DNA. Pics isoleradefrån målceller akut infekterade med HIV-1 är funktionella in vitro, eftersom de är kompetenta att integrera tillhörande vDNA i en exogent tillsatt heterolog mål-DNA. Sådan PIC-baserade in vitro-analyser integrations har väsentligt bidragit till avgränsar de mekanistiska detaljerna i retroviral integration och upptäcka IN hämmare. I denna rapport har vi vidareutveckla en uppdaterad HIV-1 PIC-analys som använder en kapslad i realtid kvantitativ Polymerase Chain Reaction (qPCR) -baserad strategi för att mäta integration aktiviteten hos isolerade infödda PIC in vitro.

Introduction

HIV-1-replikation i målcellen involverar flera steg, i stort sett grupperade i två faser: tidiga och sena händelser. De tidiga händelser börjar när HIV-1 sekventiellt binder till målet cellytereceptor CD4 och en av de två co-receptorer (CCR5 eller CXCR4) ^1. Följaktligen viruset-cellmembran säkring, och den virala kapsiden (CA) kärnan frisätts i cytoplasman ^2. CA-kärna innehåller det virala genomiska enkelsträngat RNA (ssRNA) och flera proteiner, både viralt och cellulärt ursprung. CA-associerade virala proteiner inkluderar omvänt transkriptas (RT) och integras (IN), två enzymer som förmedlar viktiga steg under tidiga händelser i virusreplikation. RT och IN-funktionen i samband med nukleoprotein komplex, nämligen omvänd transkription Complex (RTC) och pre-integrationskomplex (PIC), respektive ^{3, 4, 5} <sup>, ^6. Ändarna på virala ssRNA genomet hamnterminalen upprepa (R) elementen som gränsar till den unika sekvenser U5 (vid 5 'änden) och U3 (vid 3'-änden). RTC omvandlar den virala ssRNA genomet i en dubbelsträngad (ds) DNA-kopia (vDNA). Denna omvända transkriptionen resulterar också i dubbel U5 och U3-sekvenser, vilket genererar långa terminala upprepningar (LTR) vid båda ändarna av vDNA ^{7, 8.} Därefter katalyserar PIC-associerade IN två sekventiella biokemiska reaktioner som möjliggör integrationen av vDNA: t in i värdkromosomen ^{9, 10, 11.} Först, i cytoplasman, IN multimerer fästa ihop de båda LTR ¹² och klyva en dinukleotid från vardera av de 3'-terminala ändarna. Detta 3'-änden bearbetning ger en hydroxylgrupp vid varje 3'-ände (CA _OH) av vDNA: t.Nästa, trafikerar PIC till kärnan, varvid IN använder vDNA CA _OH som en nukleofil för att skära båda strängarna av det kromosomala DNA på ett förskjutet sätt. Samtidigt, IN skarvar koordinerat båda ändarna av vDNA: t till de resulterande fosfodiesterbindningar på motsatta strängar av kromosomalt DNA. Efter denna strängöverföringssteg, avlägsnar värdcellmaskineriet de två oparade nukleotider vid 5'-ändarna av vDNA: t och reparationer de följande enkelsträngade gap vid korsningen av integrationsstället. De tidiga händelser således kulminera med inrättandet av ett integrerat DNA-kopia (provirus) av HIV-1-genomet. Proviruset tillhandahåller en lämplig miljö för effektiv viral genexpression, vilket initierar senare händelser, inklusive uttrycket av viruskodade proteiner; montering av omogna virus; och spirande, release, och mognad i infektiösa virioner ^13.

Renat rekombinant retroviral IN är behörig attgenomföra in vitro, både 3'-end bearbetning och sträng överföringar på exogent medföljande LTR-liknande substrat-DNA. Biokemiska studier med sådan renat rekombinant IN har avslöjat kritiska aspekter av vDNA integration ^{14, 15, 16, 17.} Emellertid, till skillnad från vid naturlig infektion, detta in vitro biokemisk reaktion stöder inte samordnat integrering av båda ändarna av substrat-DNA in i mål-DNA. I kontrast, retrovirala PIC isolerade från akut infekterade celler concertedly integrera båda ändarna av den endogena vDNA in heterolog mål-DNA. Detta ledde till utbredd och efterföljande förfiningar av I n Vitro Integration (IVI) analyser med hjälp av isolerade infödda PIC.

I den första rapporterade retrovirala IVI-analysen, cytoplasmatiska extrakt från celler infekterade med en rekombinant murinLeukemivirus (MLV) härbärgerande E. coli supF-genen i dess LTR tjänade såsom källa för IN-aktivitet, och DNA: t av en mutant lambdafag defekta i lytisk tillväxt var exogent tillhandahålls som mål-DNA. Framgångsrik integration av rekombinant MLV DNA kopiera i fag DNA och den efterföljande supF uttryck ledde till återupprättande av plackbildande förmåga rekombinanta fager. Detta är dock experimentella strategi mödosam och integrationsåtgärder på ett indirekt sätt. För att ta itu sådana förbehåll ades en Southern blöt-baserad analys indirekt ändmärkning, som kvantifierar PIC-associerade IVI-aktivitet som ett mått på den endogena vDNA integreras i exogen linjäriserade bakteriofag PhiX174 DNA, utvecklade ^{sex, 7, 18.} Även om denna metod ger ett direkt mått på integrationshändelser är relativt höga halter av PIC preparatet krävs, som fortfarande är en tekniskt utmanandesträvan. För att kringgå detta har kapslade PCR-baserade analyser kräver endast blygsamma mängder av bilder utvecklats ^{4, 5, 19.}

I denna rapport beskriver vi en uppdaterad version av en innesluten PCR-baserad in vitro-metod fram för att sammanfatta den HIV-1 PIC-medierad integration aktivitet som inträffar under naturlig infektion. Denna metod använder cytoplasmiska extrakt av HIV-1-infekterade målceller som en källa av endogen PIC aktivitet, som mäts med en realtids kvantitativ Polymerase Chain Reaction (qPCR). Förfaranden för att isolera PIC och mäta deras integrationsarbetet anpassas, med ändringar, från protokoll som offentliggjorts av Engelman laboratorium ^20. I denna metod, är PIC-associerade integration aktivitet initieras genom att tillhandahålla en exogen linjärt mål-DNA ^21, och DNA-produkter som härrör fråndenna integrationsreaktionen renas och används som utgångsmaterial för efterföljande PCR-baserad kvantifiering. I första omgången konventionell PCR är de virala-mål-DNA korsningar amplifieras genom användning av lämpliga primrar. I den andra omgången qPCR är LTR-specifika primers användas för att specifikt berika vDNA befolkningen från första omgången PCR-produkter. Se protokollenheten för en detaljerad beskrivning av denna metod.

In vitro-studier med retrovirala ansvariga har lett till betydande framsteg i vår förståelse av mekanismen för retroviral DNA-integration och i utvecklingen av in-hämmare. Baserat på den senaste tidens ökade fokus på kartläggning HIV-1 platser integrations bestämma roll av virala och värdfaktorer i HIV-1 integration, och utveckla nya antivirala läkemedel i kampen mot läkemedelsresistens, tänka vi ett ökat intresse och en utbredd användning av IVI-analyser , som den som beskrivs i denna rapport. Detta, i sin tur, kommer att leda tillframtida förbättringar i metoden och därmed diversifiera omfattningen av dess tillämpningar.

Protocol

1. Virusproduktion OBS: För att generera höga titrar av infektiöst HIV-1, transfektera humana embryonala njur (HEK) cellinje 293T med en smittsam HIV-1 molekylär klon med hjälp av en aktiverad dendrimer-baserade transfektion reagens. Det har observerats att den kalciumfosfattransfektion metod ger jämförbara resultat. I en Biosäkerhetsnivå 2 (BSL2) lab, frö 3 x 10 6 293T celler per 10 cm skål i 8 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 10% f…

Representative Results

Isolering av HIV-1 ansvariga En schematisk bild av det protokoll som används för isolering av HIV-1 ansvariga från akut infekterade Sup-T1-celler visas i figur 1. Detta protokoll är härledd från de metoder som beskrivits av Engelman et al. 19, 20. HIV-1 ansvariga är nukleoprotein komplex som är monterade i infekterade …

Discussion

Biokemiska analyser av retrovirala ansvariga har gett viktiga insikter i mekanismen för retroviral DNA-integration. Mätning av integrationen aktiviteten hos retrovirala PIC kan uppnås genom plackbildningsanalys, Southern blot-analys, och kapslade qPCR. Den experimentella taktik som plackanalysen är arbetskrävande och utnyttjar en indirekt metod för att mäta integration ^{6, 7, 18.} Southern blot-baserade analyser åtgärd i…

Materials

Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO/Invitrogen	10437-028
Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS)	GIBCO/Invitrogen	10438-026
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	GIBCO/Invitrogen	11995-065
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	GIBCO/Invitrogen	11875-093
Phosphate buffered saline (PBS) (1X)	GIBCO/Invitrogen	20012-027
Trypsin-EDTA (0.25%)	GIBCO/Invitrogen	25200-056
Penicillin-Streptomycin solution (100x)	Cellgro/Mediatech	30-002-CI
HEK293T cells (293T)	American Type Culture Collection (ATCC)	CRL-3216
HIV-1 proviral molecular clone pNL4-3	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	114
PolyFect transfection reagent	Qiagen	301107
DNase	Calbiochem/Merckmillipore	260913
Immulon 2HB 96-well plates	Thermo Scientific	3455
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
ELISA coating antibody: anti-CA-183-H12-5C monoclonal antibody	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	1513
ELISA wash solution (0.2% Tween-20 in PBS)	—	—
Donor bovine serum	Gibco/Invitrogen	16030074
Blocking Buffer (5% donor bovine serum in PBS) – Prepare fresh before use.	—	—
Sample diluent (SD) buffer (10% donor bovine serum and 0.5% Triton X-100 in PBS) – Sterilize using 0.22 micron pore-size syringe filter and store aliquots at 4°C.	—	—
Recombinant p24 protein (Full-length CA protein was expressed from pET21a-CA plasmid in E. coli BL21-DE3 and purified as described in Ref # —-)	Dr. Wesley Sundquist	—
HIV IgG	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	3957
Goat anti-human IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, HRP conjugate	Pierce/ThermoFisher	31412
TMB Microwell Peroxidase substrate system	KPL, Inc.	50-76-00
SupT1 cells	American Type Culture Collection (ATCC)	CRL-1942
HEPES pH 7.2-7.5 (ready-to-use solution)	GIBCO/Invitrogen	15630-080
Potassium chloride (KCl) solution	Sigma-Aldrich	60142
Magnesium chloride (MgCl2) solution	Sigma-Aldrich	M1028
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815
Aprotinin	Sigma-Aldrich	A6106
Digitonin	Sigma-Aldrich	D141
RNase A	Invitrogen	12091-021
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
phiX174 Replicative Form 1 DNA	Promega	D1531
PhiX174-F primer: 5’-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3’ PhiX174-R primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’	Invitrogen and/or IDT-DNA
dNTP mix	Promega	U1515
Go Taq DNA Polymerase	Promega	M3005
Qiaquick gel extraction kit	Qiagen	28706
Ultrapure distilled water	Invitrogen	10977-015
Tris-EDTA (TE) buffer (100X)	Sigma-Aldrich	T9285
Sodium dodecyl sulphate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0	Sigma-Aldrich	E7889
Proteinase K (20 mg/ml ready-to-use solution)	Qiagen	19131
Phenol (equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0 and 1 mM EDTA)	Sigma-Aldrich	P4557
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
Glycogen (5 mg/ml solution)	Ambion/Invitrogen	AM9510
Sodium acetate (3M, pH 5.2)	Sigma-Aldrich	57899
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
First round LTR primer: 5’-GTGCGCGCTTCAGCAAG-3’) First round phiX174 primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’	Invitrogen and/or IDT-DNA	—
Second round LTR-R primer: 5’-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3’ Second round LTR-U primer: 5’-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3’; Second round Taqman probe:  5’-56– FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC CTTGAGTGC/36-TAMRA/-3’	Invitrogen and/or IDT-DNA	—
iQ Supermix	Bio-Rad	170-8862