L'isolement, la différenciation, et la quantification des anticorps humain sécrétant des cellules B du sang: ELISpot comme indicateur fonctionnel de humorale Immunité

Summary

Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.

Abstract

La caractéristique de l'immunité humorale est de générer ASCs fonctionnels qui synthétisent et sécrètent Ab spécifique à un antigène (Ag), par exemple un agent pathogène, et sont utilisés pour la défense de l'hôte. Pour la détermination quantitative de l'état fonctionnel de la réponse immunitaire humorale d'un individu, à la fois sérique et d'ABS ASCs de circulation sont généralement mesurés comme des lectures fonctionnelles. Chez l'être humain, le sang périphérique est l'échantillon le plus commode et facilement accessible, qui peut être utilisé pour la détermination de la réponse immunitaire humorale induite par les cellules hôtes B. sous-ensembles distincts de lymphocytes B, y compris les ASC, peuvent être isolés directement à partir du sang périphérique par sélection avec des microbilles conjuguées à Ab spécifique à la lignée ou par tri cellulaire par cytométrie de flux. De plus, les cellules B naïves et mémoire purifiés peuvent être activées et différenciées en ASCs en culture. Les activités fonctionnelles des ASC pour contribuer à la sécrétion Ab peuvent être quantifiés par ELISpot, qui est un essai enzyme qui convergetest de immunoabsorbance lié en (ELISA) et les technologies de transfert de Western pour permettre l'énumération des ASCs individuelles au niveau d'une seule cellule. En pratique, le test ELISpot a été de plus en plus utilisé pour évaluer l'efficacité du vaccin à cause de la facilité de manipulation d'un grand nombre d'échantillons de sang. Les procédés d'isolement des cellules B humaines à partir de sang périphérique, de la différenciation des cellules B en ASCs in vitro, ainsi que l'emploi d' un test ELISPOT pour la quantification du nombre total IgM et IgG ASCs seront décrites ici.

Introduction

les cellules B jouent un rôle central dans le développement de l'immunité humorale. Ils se développent d'abord dans la moelle osseuse et entrent dans la circulation sanguine sous forme de cellules B naïves, qui peuvent migrer dans les tissus lymphoïdes, tels que la rate, les ganglions lymphatiques et amygdales, pour un développement ultérieur. Après Ag rencontre, certaines cellules B naïves migrent dans les follicules lymphoïdes, où les cellules du centre germinatif B peuvent se différencier en cellules de mémoire B et plasmoblastes (PBS) / cellules plasmatiques (PC). Alors que la plupart du PBS / PC de sortie dans le flux de sang, quelques éventuellement résident dans la moelle osseuse à subir une différenciation terminale dans les PC à long terme ^1. Les cellules B en circulation sont hétérogènes, et à l' état d' équilibre, PB / PC sont rares dans le sang périphérique ^2. En raison de la disponibilité de marqueurs de surface spécifiques à la lignée, la cytométrie de flux est devenue une méthode populaire pour l'identification et la caractérisation des sous-ensembles de cellules B dans le sang périphérique. Une application prolongée de cytometr de fluxy est l'addition d'une fonction de tri de cellules, ce qui permet la séparation et l'isolement des sous-ensembles individuels de cellules B avec une pureté élevée. Sur la base de l'expression de récepteurs de surface spécifiques à différents stades de développement, des cellules B humaines en circulation sont généralement classés en trois sous – populations principales: les cellules B naïves (CD19 ⁺ CD27 ^– CD38 ^-), de cellules B à mémoire (CD19 ⁺ CD27 ⁺ CD38 ^-), et PB / PC (CD19 ⁺ CD27 ⁺ CD38 ^{+) 3-4} (Figure 1). Les cellules B naïves, par nature, ne sont pas rencontrées Ags. Cependant, ils peuvent être différenciées en cellules IgM ⁺ CD27 ⁺ B mémoire. Bien que les cellules B naïves sont homogènes en exprimant le récepteur de l' antigène des lymphocytes B (BCR) -Associated molécules (par exemple, CD19, CD20 et CD22) , ils sont hétérogènes dans leur répertoire d' immunoglobulines ^5. La majorité des cellules CD27 ⁺ B mémoires peuvent être différenciées en CD27+ / CD38 ⁺ salut PB / PC ^6. En outre, les cellules B mémoires et PB / PC sont polyclonaux et présentent une hétérogénéité de développement et fonctionnelle ^4-7. PB / PC en circulation sont normalement de courte durée et n'expriment CD138, mais celles faites à installer dans la moelle osseuse sera terminale différencier et de devenir à long terme. Terminally PC différenciées expriment CD138 et régulent les molécules de CD27 sur leurs surfaces ^8. Étant donné que PB et PC sont capables de sécréter Abs, dans de nombreuses occasions, ils sont collectivement désignées comme ASCs. En revanche, ni les cellules B naïves ni les cellules B mémoires peuvent produire des quantités appréciables de Abs ^9-10. Néanmoins, lorsqu'il est isolé, les deux cellules B naïves et mémoires peuvent être différenciées en ASCs en 3 – 10 jours lorsqu'il est placé dans les conditions de culture appropriées ^{6, 11-15.} En fait, ASCs dérivés d'actions in vitro de différenciation expressions de surface similaires de CD27 et CD38 avec ceux fr directement isoléle sang périphérique om ^6. En outre, les ASCs différenciées in vitro expriment un faible niveau de CD20 de surface, comme celle de circulation PB / PC ^6. Bien que les ASCs de culture dérivés sont de courte durée, ils peuvent sécrètent Abs, ce qui indique qu'ils sont fonctionnellement compétents et capables de contribuer à l'immunité humorale.

Les deux ELISA et ELISpot sont de loin les méthodes les plus couramment appliquées avec qui pour obtenir des informations fonctionnelles sur la réponse immunitaire humorale. ELISA est un test basé sur une plaque de 96 puits, et il est souvent utilisé pour mesurer les titres de sérum Abs Ag-spécifique et d' autres analytes (par exemple, des cytokines). Il est commode et évolutive. ELISA est conçu pour utiliser un dosage enzymatique en phase solide pour détecter la présence d'Ac ou d' autres substances, telles que le sérum, dans un échantillon liquide ^16. Les lectures de tests ELISA sériques ont été largement utilisés pour représenter la réponse immunitaire du corps. Un outil nécessaire pour l'acquisition de readouts de dosages ELISA est un lecteur de microplaques spectrophotométrique. Le lecteur peut déterminer la densité optique (DO) des produits finaux résultant généralement de la réaction de la peroxydase de raifort (HRP) conjuguée à Abs de détection et de leurs substrats spécifiques ^17. En ce qui concerne le rapport de la réponse immunitaire humorale, les taux sériques Ab déterminés par ELISA indiquent le collectif, mais pas individuelle, le rendement de l'ASC dans le corps. En outre, ELISA ne tient pas compte de la participation par les cellules B de mémoire, qui ne sécrètent pas Abs.

Comme ELISA, ELISpot est une méthode largement utilisée pour détecter et surveiller la réponse immunitaire dans des échantillons de sang périphérique ^17-18. ELISpot est une technique liée à un ELISA en sandwich. Dans ce document, les cellules sont placées dans le difluorure de polyvinylidène (PVDF) puits de membranes-backed de microplaques de 96 puits pour une culture à court terme. Le test ELISPOT est analogue à effectuer un transfert de Western sur une microplaque et developing, les taches sur la membrane de PVDF dans chaque puits. Un système de lecteur ELISpot automatisé ou un stéréomicroscope pour le comptage manuel est nécessaire. Le principal avantage d'un test ELISPOT pour la détection d'une réponse immunitaire est sa sensibilité exceptionnelle à la quantification des ASC et des cellules sécrétant des cytokines. Il rend compte de leurs activités fonctionnelles dans l'immunité humorale et cellulaire, respectivement. Dans la mesure de la fonction immunitaire humorale, les taux sériques Ab déterminés par ELISA et le nombre de ASCs énumérés par ELISpot sont souvent corrélées, mais les lectures de données de ces deux essais ont des différences dans les implications fonctionnelles ^19-20. Le principal avantage de ELISpot est sa sensibilité de la méthode. Le niveau de titres Ab sériques tel que rapporté par ELISA est présenté comme semi-quantitative des lectures de DO, indiquant le niveau Ab relative, ou plus quantitative, comme les lectures de concentration lorsqu'une quantité connue des isotypes appropriés de Abs est inclus pour référence. En revanche, les résultats d'un test ELISPOT sont presented comme le nombre absolu de ASCs dans un pool de cellules d'intérêt (par exemple, des cellules non fractionnées périphériques mononucléaires du sang (PBMC) et des cellules B purifiées à partir de PBMC). ELISpot peut détecter une seule ASC, mais nécessite des quantités ELISA Ab à partir ASCs pour atteindre des concentrations d'essai dépendant optimisées avant la mesure. Par conséquent, ELISpot est évidemment supérieure à ELISA de la sensibilité de la quantification. En outre, ELISpot est également adapté pour quantifier les ASCs différenciées in vitro à partir de cellules B à mémoire activés. les cellules mémoire B ne sécrètent pas Abs, mais peuvent se différencier en ASCs lors de l'activation; ils ont donc aucune contribution à Abs sériques détectés par ELISA. Ainsi, ELISpot est la méthode de choix pour la mesure de la réponse immunitaire des cellules circulantes B mémoires après son activation en culture. Elle permet la surveillance de l'entretien d'une immunité humorale à long terme.

Protocol

le sang périphérique humain doit être obtenu à partir de donneurs sains en vertu du consentement éclairé, et l'utilisation d'échantillons de sang doivent être conformes aux lignes directrices approuvées établies par différents conseils d'examen institutionnels. Dans cette étude, le protocole à utiliser le sang humain dans une démonstration des résultats de cytométrie de flux (Figure 1) et des tests ELISpot (figure 3) a été approuvé par la Commission de révision interne de Nat…

Representative Results

PBMC ont été appauvries en globules rouges et des cellules adhérentes (étapes 01.02 à 01.07). Une aliquote (2 x 10 6) des cellules ont été soumises à une analyse par cytométrie de flux pour illustrer les populations de cellules B naïves, les cellules B à mémoire, et le PBS / PC dans le sang périphérique (figure 1). Dans les CMSP de ce donneur, environ 10% des lymphocytes sont des cellules B CD19 +. Dans le compartiment des cellules B, …

Discussion

L'isolement et la purification des cellules B du sang périphérique humain

Normalement, les globules rouges peuvent être efficacement éliminées par rompues et le tampon de lyse (étape 1.2). Il est important de ne pas laisser incuber les PBMC avec le tampon de lyse des globules rouges supérieure à 5 min, comme la viabilité des cellules peut être affectée par le chlorure d'ammonium. En variante, les globules rouges et les plaquettes peuvent être éliminés simultanément par le…

Materials

BD Vacutainer K2E	BD Biosciences	367525	10 ml tube
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02	endotoxin-free
Trypan blue 0.5% solution	Biological Industries	03-102-1B
IMag Human B lymphocyte enrichment set	BD Biosciences	558007
Biotinylated CD27 mAb	Biolegend	302804	clone O323
Streptavidin magnetic microbeads	BD Biosciences	9000810
15 ml Falcon tubes	BD Falcon	352196
Blue nylon mesh cell strainer, 40 μm	BD Falcon	352340
Anti-human CD19-APC	Biolegend	302212	clone HIB19
Anti-human CD27-eFluor 450	eBioscience	48-0279-42	clone O323
Anti-human CD38-PE-Cy7	Biolegend	303516	clone HIT2
Anti-human CD38-PE-Cy7	BD Biosciences	560677	clone HIT2
Anti-human CD45-FITC	Biolegend	304006	clone HI30
Anti-human CD45-FITC	BD Biosciences	555482	clone HI30
Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5	Biolegend	124213	clone LG.3A10
Anti-human CD27-PerCP Cy5.5	BD Biosciences	65429	clone L128
Anti-human CD19-FITC	Miltenyi Biotec	130-098-064	clone LT19
Anti-human CD19-FITC	GeneTex	GTX75599	clone LT19
Anti-human CD20-FITC	BD Biosciences	555622	clone 2H7
biotinylated anti-human CD27	Biolegend	302804	clone O323
biotinylated anti-human CD27	eBioscience	13-0279-80	clone O323
7-aminoactinomycin D (7-AAD)	BD Biosciences	559925
CpG (ODN 2006)	InvivoGen	tlrl-2006	type B CpG
Recombinant human IL-2	PeproTech	200-02
Recombinant human IL-10	PeproTech	200-10
Recombinant human IL-21	PeproTech	200-21
Recombinant human sCD40L	PeproTech	310-02
Protein A of S. aureus Cowan (SAC)	Sigma-Aldrich	82526
Pokeweed mitogen (PWM)	Sigma-Aldrich	L9379
MultiScreen filter plates, 0.45 µm pore size	Merck Millipore	MSIPS4510	sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane
BCIP/NBT solution	Sigma-Aldrich	B6404
BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate	Merck Millipore	ES006
Human IgG	Jackson ImmunoResearch	009-000-003
Human IgG, Fc fragment	Jackson ImmunoResearch	009-000-008
F(ab')2 fragment of goat anti-human Ig (IgG+IgM+IgA)	Jackson ImmunoResearch	109-006-127
Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fcγ fragment specific	Jackson ImmunoResearch	109-055-008
Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fcµ fragment specific	Jackson ImmunoResearch	109-055-095
Goat anti-human IgG-peroxidase, Fcγ fragment specific	Jackson ImmunoResearch	109-035-008
Goat anti-human IgM-peroxidase, Fcµ fragment specific	Jackson ImmunoResearch	109-035-095
BD ELISPOT AEC substrate kit	BD Biosciences	551951
C.T.L. ImmunoSpot analyzer	C.T.L.