Sporulation efficace de<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Dans un 96 Multiwell Format

Résumé

Ici, la sporulation de Saccharomyces cerevisiae est réalisée dans un format multipuits 96.

Résumé

Pendant les périodes de stress nutritionnel, Saccharomyces cerevisiae subit une gamétogenèse, connue sous le nom de sporulation. Les cellules de levure diploïdes qui sont privées d’azote et de carbone initieront le processus de sporulation. Le processus de sporulation comprend une méiose suivie de la formation de spores, où les noyaux haploïdes sont emballés dans des spores résistantes à l’environnement. Nous avons développé des méthodes pour la sporulation efficace de levures bourgeonnantes dans 96 plaques multipuits, afin d’augmenter le débit de criblage des cellules de levure pour les phénotypes de sporulation. Ces méthodes sont compatibles avec le criblage avec des plasmides contenant des levures nécessitant une sélection nutritionnelle, lorsque des milieux minimaux appropriés sont utilisés, ou avec le criblage de levures avec des altérations génomiques, lorsqu’un régime de présporulation riche est utilisé. Nous constatons que pour cette méthode, l’aération pendant la sporulation est essentielle à la formation des spores, et nous avons mis au point des techniques pour assurer une aération suffisante qui sont compatibles avec le format de plaques multipuits 96. Bien que ces méthodes n’atteignent pas le niveau typique de sporulation de ~80 % qui peut être atteint dans des expériences basées sur des flacons de grand volume, ces méthodes permettront d’atteindre de manière fiable un niveau de sporulation d’environ 50 à 60 % dans des plaques multipuits de petit volume.

Introduction

La sporulation chez la levure en herbe a été étudié pour donner un aperçu de nombreux aspects de la biologie, y compris le contrôle de la ségrégation des chromosomes lors de la méiose ^1, les mécanismes de recombinaison génétique ^2, le contrôle du développement par la cellule de signalisation ^3, contrôle nutritionnel du développement ^4, la transcription régulation du développement ^5, et l'examen de la formation de spores ^6. La formation de spores comprend un événement de division cellulaire nouvelle impliquant la formation de nouveaux compartiments à l' intérieur de la membrane de la cellule mèr....

Protocole

1. Préparation de sporulation

Remarque:. Les milieux décrits dans ce protocole sont réalisés en utilisant des recettes et des méthodes standard ^13,17 Le tableau 1 donne la formulation pour 1 L des différents médias utilisés dans ce protocole.

bactopeptone

Extrait de levure

gélose Bacto

Résultats

Pour évaluer ce protocole, l' efficacité de sporulation obtenus à partir de cellules sporulantes dans des plaques multipuits (comme décrit ci - dessus) ont été comparées à des cellules sporulées en utilisant des volumes plus importants dans des flacons (tableau 2). L'utilisation de plaques multipuits n'a pas atteint le rendement élevé vu quand sporulation dans des flacons, où ~ 80% d'efficacité peut être régulièrement vu. Sporulation dans des plaque.......

Discussion

Nous présentons ici un protocole de sporulation SK1 levure dans un format de 96 multipuits. Aération est la clé pour la sporulation efficace, ce qui nécessite l'utilisation soit d'un barreau d'agitation ou une perle de verre dans chaque puits. Lorsque les cellules sont sporulés dans une plaque multipuits 96 dans un incubateur à agitation sans soit une perle ou une barre d'agitation, les cellules ne sporulation pas efficacement. Seule une petite augmentation de l'efficacité de la sporulation est obser.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nunc 1,3 ml DeepWell Plates ThermoScientific		260251	Utilisé pour la sporulation
Nunc 2,0 ml Plaques DeepWell	ThermoScientific	278743	Utilisé pour la croissance par présporulation, étape 1.2.3
Bille de verre de 3 mm	Fisher	11-312A	Utilisé pour la sporulation
Barre d’agitation de 5 mm x 2 mm, paquet de 12	Fisher	14-511-82	Utilisée pour la sporulation
96 bien frogger	V& P Scientific	VP407	nécessaire pour l’étape 1.2
copieur de bibliothèque	V& P Scientific	VP381	nécessaire pour l’étape 1.2 ; à utiliser avec la
boîte de Pétri rectangulaire	ThermoScientific	264728	nécessaire pour l’étape 1.2
Bacto Peptone	BD	211677	nécessaire pour les milieux
Extrait de levure	BD	212750	nécessaire pour les milieux
Bacto Agar	BD	212750	nécessaire pour les milieux
Dextrose	Fisher	D16-3	nécessaire pour les milieux
Acétate de potassium	Fisher	P171-500	nécessaire pour les milieux
Glycérol	Fisher	G33-500	nécessaire pour les milieux
Plaque inférieure en verre noir à 96 puits	MatTek	PBK96G-1.5.5-F	nécessaire pour l’étape 2.4

frogger