De<em> Drosophila</em> Imaginal Disc Tumor Model: Visualisering og Kvantifisering av genekspresjon og Tumor Invasivitet Bruke Genetic Mosaikk

Summary

Denne protokollen demonstrerer hvordan å generere fluorescerende merket, genetisk definerte klonale svulster i Drosophila øye / antennal imaginal plater (EAD). Den beskriver hvordan du kan dissekere EAD og hjernen fra den tredje instar larver og hvordan å behandle dem til å visualisere og kvantifisere genuttrykk endringer og tumor invasivitet.

Abstract

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

Introduction

Kreft representerer en av de mest genetisk heterogen gruppe av sykdommer hvis forekomst og dødelighet er dramatisk økende, spesielt blant eldre over hele verden. Cancer stammer klonalt fra en tumor-initiering celle som unnslipper iboende tumor-suppressor-mekanismer og deler ut av kontroll. Den gradvise akkumulering av genetiske lesjoner som i fellesskap fremmer vekst, spredning og bevegelighet mens hemme død og differensiering forvandler den første godartet overvekst i en svært ondartet, metastatisk og dødelig svulst. Det er blitt klart at i tillegg til genetiske endringer, tumorprogresjon krever endringer i den omgivende stroma og krysstale mellom tumor og multiple celletyper (for eksempel fibroblaster, immun og endotelceller) i dets mikromiljøet. Forstå de molekylære prinsippene malign transformasjon inkludert tumor-stroma interaksjoner er av stor betydning for utvikling av foresjon og tidlig screening strategier, samt nye og effektive behandlinger for å bekjempe kreft metastasering og resistens.

Frukten fly Drosophila melanogaster har blitt et attraktivt system for kreftforskning ^1-4 på grunn av sin raske generasjonstid, bemerkelsesverdig bevaring av signale noder mellom fluer og mennesker, begrenset genetisk redundans og vell av avanserte genetiske verktøy som letter manipulering av nesten alle genet i en midlertidig og romlig begrenset måte. Genetisk definerte tumorer av forskjellig malignitet kan reproduserbart konstruert i Drosophila ved å innføre gevinst-og tap-av-funksjon mutasjoner i en undergruppe av progenitorceller i en ellers vill-type vev ved å bruke den teknikk MARCM ^5. Den MARCM verktøy kombinerer FLP / FRT (FLP recombinase / FLP Recognition Target) -mediert mitotisk rekombinasjon ⁶ med FLP-out ⁷ og Gal4 / UAS (Upstream Activation Sequence) ⁸ mål genetekspresjonssystemer ^9. Med denne metoden ekspresjon i alle UAS-baserte transgenet, inkludert onkogen eller fluorescerende protein cDNA eller innovervendte DNA gjentar for dsRNA-induserte genet Slå, vil være begrenset til en klon av celler som har mistet en bestemt genetisk locus og en Gal4 repressor på grunn av rekombinasjon (figur 1A). Klonale patcher merket med grønt fluorescerende (GFP) eller rød fluorescerende proteiner (f.eks RFP, DsRed, mCherry) lett kan spores gjennom hele utviklingen, isolert og analysert. Viktigere, kan deres atferd sammenlignes direkte til tilstøtende villtype vev. Således spørsmål relevant til celleautonome og ikke-autonome virkninger av genetiske lesjoner kan hensiktsmessig studeres. I likhet med pattedyr, bare kloner der flere onkogene lesjoner kombineres bli ondartet i Drosophila og rekapitulere sentrale kjennetegnene ved pattedyr kreft. De overproliferate, unngå apoptose, indusere betennelse, bli udødelig og invasive, slutt å drepe verten ^10-17.

Her beskriver vi en protokoll for å generere genetisk definerte klonale svulster i øyet / antennal og hjernevev av Drosophila larver bruker MARCM teknikk. Fremgangsmåten baserer seg på en MARCM tester lager som uttrykker gjær FLP rekombinase under kontroll av den eyeless forsterker (eyFLP) ^18,19. På denne måte blir GFP-merket kloner generert på både peripodial og søyle epitelet i EAD og neuroepithelium av hjernen gjennom embryonale og larvestadiet (figur 1A, B og referanse ^20). Kloner lett kan følges helt til voksen alder som EAD utvikler seg til den voksne øyet, antenne og hodet kapsel mens neuroepithelium gir opphav til neuroblasts som produserer differensierte optiske lobe nerveceller.

For å lette omfattende molekylær, funksjonell og fenotypisk karakterisering av mosaikk vev, vi deskriver en protokoll for disseksjon av EAD og hjernen fra den tredje instar larver og skissere hvordan å behandle dem i tre forskjellige programmer: (i) påvisning av transgene fluorescerende reportere og farging, (ii) kvantifisering av tumor invasivitet og (iii) analyse av genuttrykk endres ved hjelp av en kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) eller en high-throughput mRNA sekvensering (mRNA-seq) (figur 1C).

Den immunofarging protokollen kan brukes til å visualisere en hvilken som helst protein av interesse sammen med et spesifikt antistoff. Transgene fluorescerende transkripsjons reportere gi enkel og presis spatiotemporal informasjon om aktiviteten til en bestemt signalveien. Cell-avstamning spesifikke journalister, på den annen side, reflektere kvalitative og kvantitative endringer i celle populasjoner innenfor mosaikk vev og blant svulster i forskjellige genotyper. Kvantifisering av invasiv atferd letter sammenligningen av tumor malignitet mellom genotypes. Endelig protokollen beskriver innsamling og behandling av mosaikk EAD for RNA isolering er egnet for både små og store nedstrøms applikasjoner som revers transkripsjon fulgt av henholdsvis QRT-PCR og genom-wide mRNA-seq,. De kvalitative og kvantitative data fra disse analysene gir ny innsikt i den sosiale atferden til klonale svulster. Dessuten produserer de et solid grunnlag for funksjonelle studier på rollen til enkelte gener, genetiske nettverk og svulstens mikromiljø i ulike stadier og aspekter av tumorigenesis.

Protocol

MERK: Dette arbeidet utnytter eyFLP1; handling> y +> Gal4, UAS-GFP; FRT82B, badekar-Gal80 MARCM 82B Grønn tester linje 11. Kryssing av MARCM 82B Grønne tester jomfruer til hanner av stammer som w; UAS-en; UAS-b RNAi, FRT82B c mut genotype vil gi avkom som mitotisk rekombinasjon vil oppstå mellom de rette armer av 3. homologe kromosomer. På denne måten vil kloner homozygote mutante genet for c plassert distalt til den FRT82B området bli generert inn…

Representative Results

For å demonstrere potensialet i eyFLP-MARCM teknikk for å generere GFP-merket flekker av definerte genotyper i Drosophila EAD, ble tre typer av kloner indusert: (1) kontroll uttrykker GFP bare, (2) maligne tumorer som uttrykker en onkogen form av små G-protein Ras (Ras V12) i en bakgrunn av homozygot tap av et tumorsuppressorgen frihåndstegning (SCRIB 1), og (3) tilgroing, men ikke-invasiv ras V12 SCRIB en JNK…

Discussion

Teknikkene for å generere genetiske mosaikk i Drosophila er blant de mest avanserte verktøy for å analysere og manipulere gen-funksjon ^33. Den eyFLP-MARCM system har vist seg kraftig og robust som det lar induksjon av visuelt merket, genetisk definert kloner i en romlig begrenset måte, dvs. i vev der eyeless Enhancer er aktiv ^9,18. Dette er særlig viktig når flere genetiske lesjoner er kombinert i de samme cellene. Mens disse sterkt avvikende lapper tillate larveutv…

Materials

Agar	Gewürzmühle Brecht, Eggenstein, Germany	00262-0500	Fly food recipe: Prepare 20 L fly food with 160 g agar, 360 g yeast, 200 g soy flour, 1.6 kg yellow cornmeal, 1.2 L malt extract, 300 ml light corn syrup, 130 ml propionic acid and 200 ml 15% nipagin. Fly food should be cooked for 1 hour at 85°C.
Corn syrup	Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Germany	01939
Propionic acid	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	6026.1
Cornmeal	ReformKontor GmbH, Zarrentin, Germany	4010155063948
Malt extract	CSM Deutschland GmbH, Bremen, Germany	728985
Soy flour	Stockmeier Food GmbH, Herford, Germany	1000246441010
Yeast	Werner Ramspeck GmbH, Schwabach, Germany	210099K
Methyl-4-benzoate/ Nipagin	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	H5501	Prepare a 15% stock solution with 70% EtOH
Drosophila fly food vials	Kisker Biotech, Steinfurt, Germany	789008
Vial plugs	K-TK e.K., Retzstadt, Germany	1002
Drosophila fly food bottles	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	960177
Bottle plugs	K-TK e.K., Retzstadt, Germany	1002 S
Poly(vinyl alcohol) 4-88/[-CH2CHOH-]n	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	81381	Mounting medium recipe: Dissolve 6 g Poly(vinyl alcohol) 4-88 in 39 ml Millipore H2O, 6 ml 1 M Tris (pH 8.5) and 12.5 ml glycerol. Stir overnight at 50°C and centrifuge 20 min at 5000 rpm. Add DABCO to the supernatant to get a final concentration of 2.5%. Store aliquots at -20°C.
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane/ DABCO	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	D2522
Triton X-100	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	9002-93-1
Phosphate-buffered saline/ PBS			137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 and 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 in Millipore H2O
PBST			0.1% Triton X-100 in PBS
Paraformaldehyde/ PFA	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	158127	4% PFA fixative recipe: Dissolve 4 g PFA in 80 ml Millipore H2O on a magnetic stirrer plate heated to 55 °C. Add 1M NaOH dropwise until all PFA particles are dissolved. Add 10 ml 10X PBS and adjust the pH to 7.4 with 1M HCl. Mix in 100 µl Triton X-100 and fill up with Millipore H2O to 100 ml. Store aliquots at -20°C. Avoid repeated thawing. (CAUTION: PFA is highly toxic. Prepare the PFA fixative in a fume hood. Wear a self-contained breathing apparatus, gloves and clothing. Avoid contact with skin, eyes or mucous membranes)
Bovine Serum Albumin/ BSA	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	A3059	Blocking solution recipe: Dissolve 0.3% BSA in PBST
4’,6-Diamidino-2-phenylindol Dihydrochlorid/ DAPI	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	6335	DAPI staining solution: Prepare a stock solution of 5 mg/ml in Millipore H2O and store aliquots at 4°C. Used in dilution 1:1000 in PBST.
Alexa Flour 546 Phalloidin	Invitrogen, Karlsruhe, Germany	A22283	Used in dilution 1:500 in PBST.
Mouse anti-H2 antibody	Kurucz et al., 2003		Used in dilution 1:500 in blocking solution
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK	715-175-151	Used in dilution 1:500 in blocking solution
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	11295-10
Glass embryo dish (30 mm)	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	E90
Tungsten needles	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	10130-20
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	26018-17
Microscope slides	VWR, Darmstadt, Germany	631-1553
Coverslips 22 x 22 mm (#1 Menzel-Gläser)	VWR, Darmstadt, Germany	631-1336
Coverslips 24 x 50 mm (0.13-0.16 mm)	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	1076371
Kimtech Science Precision Wipes	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	06-677-70
Dissecting stereomicroscope	Olympus, Hamburg, Germany	SZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japan)
Fluorescent stereomicroscope	Olympus, Hamburg, Germany	SZX16 (SDF PLAPO 0.8X Japan) with DP72 CCD camera	Equipped with the narrow blue bandpass filter set for excitation of GFP other blue excitable fluorochromes (excitation filter BP460-480 nm, barrier filter BA495-540 nm) and narrow green excitation and longpass barrier filter for RFP and other green excitable fluorochromes (excitation filter BP530-550, barrier filter BA575IF). Software: Olympus cellSens Standard 1.11.
Confocal microscope	Olympus, Hamburg, Germany	FV1000	Equipped with inverted IX81 microscope. Objectives: 20× UPlan S-Apo (NA 0.85), 40× UPlanFL (NA 1.30) and 60× UPlanApo (NA 1.35). Lasers: UV laser Diode LD405 (50mW), Argon laser, multi-line 457/(476)/ 488/515 (40mW), Yellow/Green laser diode LD560 (15mW) and Red Laser diode 635 (20mW). Software: Fluoview 2.1c Software
Drosophila cooled incubator	Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany	Sanyo MIR553
Squirt bottle	VWR, Darmstadt, Germany	215-8105
BD Clay Adams Nutator Mixer	VWR, Darmstadt, Germany	15172-203
ELMI Digital Rocking Shaker	VWR, Darmstadt, Germany	DRS-12
5 PRIME Isol-RNA Lysis Reagent	VWR, Darmstadt, Germany	2302700	The protocol is compatible with other TRIzol-based reagents e.g. TRIreagent from Sigma (Cat. Nr.T9424), TRIzol reagent from Thermofisher (Cat. Nr. 15596).
Diethyl pyrocarbonate/ DEPC	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	D5758	Dilute DEPC 1:1000 in Millipore H2O, stir overnight and autoclave.
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1)	ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany	15593-031
Chloroform	Merck, Darmstadt, Germany	102445
TURBO DNase (2 U/µl)	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	AM2238
Invitrogen UltraPure Glycogen	ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany	10-814-010
Sodium acetate trihydrate	VWR, Darmstadt, Germany	27652.232	Prepare a 3M Sodium acetate solution with DEPC-H2O and adjust the pH to 5.2
2-Propanol	Merck, Darmstadt, Germany	109634
Ethanol	Merck, Darmstadt, Germany	100983	Prepare a 75% EtOH dilution with DEPC-H2O.
UV/Vis-Spectrophotometre NanoDrop ND-8000	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	ND-8000
Eppendorf Microcentrifuge (Refrigerated)	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	5417R
Experion RNA StdSens Analysis Kit	Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany	7007103
Experion Automated Electrophoresis Station	Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany	7007010
SuperScript III Reverse Transcriptase	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	18080044
Oligo d(T) Primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium		Prepare 100 µM stock solutions in DEPC-H20 and store at -20°C
dNTP Mixture	Takara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, France	4030	Store aliquots of 25 µl at -20°C
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany	1855195
iQ SYBR Green Supermix	Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany	170-8882
Hard-Shell PCR Plates 96-well, thin wall	Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany	HSP9601
Microseal 'B' Film	Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany	MSB1001
rp49 Forward primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium		5' TCCTACCAGCTTCAAGATGAC 3'
rp49 Reverse primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium		5' CACGTTGTGCACCAGGAACT 3'
mmp1 Forward primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium		5' AGGGCGACAAGTACTACAAGCTGA 3'
mmp1 Reverse primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium		5' ACGTCTTGCCGTTCTTGTAGGTGA 3'