Circadian ur regulerer omkring en tredjedel af Arabidopsis transkriptomet, men andelen af gener, der føres tilbage til tidtagning fortsat ukendt. Her visualisere vi en metode til hurtigt at vurdere cirkadiske fænotyper i nogen mutant linje af Arabidopsis hjælp luminescerende billeddannelse af en circadian reporter transient udtrykt i protoplaster.
The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.
De fleste levende organismer besidder en endogen tidtager at hjælpe effektiv forhandling af daglige ændringer i miljøet. Denne tidtager, den døgnrytmen ur, regulerer mange aspekter af stofskiftet og fysiologi en organisme til at foregribe forudsigelige ændringer i det eksterne miljø. I planter f.eks foregribelse af tidsmæssigt forudsigelige patogen eller planteædende angreb reducerer stærkt samlet modtagelighed 1 – 4. Stivelse stofskifte er stramt reguleret af døgnrytmen ur at sikre, at reserverne stivelse sidste indtil daggry, om dyrket på lange eller korte dag betingelser 5. Faktisk, planter med døgnrytmen ure matcher de 24 timers miljø show øget vækstrater, kulstof fiksering satser og overlevelse satser i forhold til planter, der kører et ur af uoverensstemmende perioden 6.. Den omfattende indflydelse døgnrytmen i alle disse processer opstår i vid udstrækning fra den rytmiske regulering af op til en tredjedelaf den samlede transkriptom i Arabidopsis 7. Disse rytmiske genprodukter er involveret i en bred vifte af cellulære processer, herunder metaboliske veje, hormon-signalering, og stressreaktioner 7. Oven i det, er direkte døgnrytmen regulering af protein hjemlet ved døgnrytmen regulering af fosforylering 8 og sandsynligvis andre post-translationelle modifikationer (PTMS).
I centrum af den døgnrytmen ur, der driver denne daglige transkriptionel omprogrammering ligger et netværk af transkriptionel / translationel feedback-sløjfer (TTFLs), herunder morgen-udtrykte gener døgnrytmen ur ASSOCIATED 1 (CCA1) og sent langstrakt hypokotyle (LHY), der undertrykker udtrykket af aftenens gener TIMING aF CAB 1 (TOC1), gigantea (GI) og medlemmerne af aftenen kompleks (EF) LUX ARRHYTHMO (LUX), tidligt blomstrende 3 (ELF3), og ELF4 9-11. sammen with pseudo responsregulatorprotein -genes (PRR3, 5, 7 og 9), TOC1 undertrykker CCA1 / LHY udtryk mens EF fungerer som en positiv regulator 12-14. Yderligere på feedback-mekanismer, post-transkriptionel og posttranslationel regulering af TTFL netværkskomponenter spiller en vigtig rolle i tuning døgnrytmen. Til dato den mest rigelige PTM identificeret på døgnrytmen ur proteiner er phosphorylering 15. Phosphorylering af CCA1 af Caseinkinase 2 (CK2) påvirker dets binding til at målrette initiativtagere 16 og er vigtig for temperaturkompensation af døgnrytmen ur 17. PRR proteiner fosforyleres forskelligt over døgnrytmen cyklus, og fosforylering af TOC1 påvirker interaktion med sin negative regulator, aftenen-faset ur komponent ZEITLUPE (ZTL) 18. Disse eksempler illustrerer, hvordan PTMS og protein-protein interaktioner tune TTFL netværket i en 24-timerstranskriptionel oscillator. For en mere detaljeret introduktion til transkriptionelle ur-netværket og dets regulering, fremragende seneste anmeldelser er tilgængelige (f.eks henvisning 15).
Men hvad der er tilbage mindre klart er, i hvilket omfang rytmisk regulerede processer og andre aspekter af cellulær metabolisme foder tilbage til tidtagning mekanisme selv. Omfattende screening af Arabidopsis mutanter for ur defekter kunne vinde yderligere forståelse af hvilke mekanismer eller signalveje kan inddrages i dannelsen af 24 timers rytmer fra et TTFL netværk. Til dette formål, Kim og Somers tidligere offentliggjorte et gennembrud metode til effektiv og hurtig analyse af ur funktion i enhver Arabidopsis linje 19. Baseret på anvendelsen af forbigående ekspression i protoplaster, denne metode overgår behovet for stabile transgene linjer eller sender til luminescerende ur markør linjer. Her vil vi visualisere en højtydende protoplast isolation metode 20 kombineret med en optimeret protokol til at screene cirkadiske defekter ved luminescerende billeddannelse af forbigående udtrykt ur markører i en 96-brønds plade-læser.
Vi vil sammenligne vildtype samar- 0 Arabidopsis til velkarakteriserede ur mutanter for at bekræfte den metode, der er beskrevet her, held registrerer ændrede døgnrytme. Protoplaster afledt af disse linjer er transficeret med et reporter konstruktion, der udtrykker ildflueluciferase fra døgnrytmen CCA1 promotor, CCA1pro: LUC 19. Luciferase katalyserer flertrinsreaktion hvori luciferin omdannes til elektronisk exciteret oxyluciferin der udsender lys 21, som afbildes over tid at vurdere den periode, amplitude og fase af transkriptionelle rytmer i disse protoplaster.
Protokollen består af tre hoveddele; isolering protoplasterne, transfektion protoplasterne med reporterplasmidet, og luminescerende imaldrende. Disse tre dele bør altid udføres på en enkelt dag, anvendes frisklavet buffere og reagenser. Plantevækst og oprensning af tilstrækkelige mængder af reporterplasmid bør udføres i forvejen og er ikke visualiseret i denne protokol.
Her præsenteres en hurtig analyse til screening cirkadiske periode defekter i Arabidopsis linjer, herunder protoplastisolering, transfektion, og luminecent billeddannelse. Den døgnrytmen periode i vildtype Arabidopsis og uret mutanter cca1 / LHY, ZTL, og CCA1 -OX blev beregnet ud fra målinger af luminescens fra en CCA1pro: LUC reporter og fundet at være i overensstemmelse med publicerede data fra hele planter ved hjælp af mere tids- forbrugende transgene metoder (tabel 2). Anvendelse af dette assay til at screene Arabidopsis-mutanter undgår det oprindelige krav om at generere transgene luminescerende linier, hvilket er tidskrævende og kan kun afsløre, at en bestemt mutant udviser vildtype rytmer. En klar fordel ved denne protokol er, at enhver Arabidopsis linje kan screenes på kort tid for ændrede døgnrytmen transkriptionelle rytmer, som vil hjælpe identifikationen af flere gener, der påvirker tidtagning i planter.
<p class= "Jove_content"> Isolering af protoplaster kan være besværlig, især hvis den mutante linie viser en væksthæmmede fænotype. Tidligere rapporterede metoder til at generere protoplaster involverer skæring blade og kimplanter i tynde strimler og vakuum infiltrerende strimlerne med enzymopløsning at tillade enzymerne at nå cellevæggene 26,27. Den efterfølgende spaltning kræver mindst 3 timers inkubation i mørke for at frigive protoplasterne i enzymopløsningen. Når vakuum infiltration ikke anvendes, er inkubationstiden op til 18 timer anbefales. I den protokol, der præsenteres her, vakuum infiltration er unødvendig, fordi det epidermale cellelag uigennemtrængelig for enzymerne fjernes ved tape. Ved generering protoplaster ved at skære plantemateriale er det nødvendigt at adskille protoplaster fra cellevæggen debris efter fordøjelse; Dette gøres typisk ved filtrering af opløsningen eller oprensning deraf på en sukker gradient 27,26. Her vil enhver ufordøjet væv forbliver på autoklaven båndet efterfordøjelse, så filtrering og sukker gradient oprensning af protoplasterne kan udelades. Der er en chance for, at stress som følge af langvarig protoplasting procedurer påvirker cellernes levedygtighed og døgnrytmen ur. Den tape-baseret protoplasting metode 20 visualiseret her giver et stort antal protoplaster; og i betragtning af levedygtigheden af celler over en døgnrytmen tidsserier og de matchende periode længder af protoplaster og hele planter (tabel 2), er den metode, der er beskrevet her foretrækkes frem alternative metoder til at generere protoplaster.Det transfektion trin i protokollen er et afgørende skridt, at virkninger på levedygtighed protoplaster. PEG-opløsningen muliggør DNA'et, der skal leveres ind i cellen, og begge inkubationstiden i denne opløsning (trin 3.4) og procentdelen af PEG bør bestemmes empirisk. Den normale koncentration er 20%, med lavere koncentrationer reducerer transformeringen effektivitet og højerekoncentrationer reducerer levedygtighed 28. Inkubationstid så kort som fem minutter kunne give effektiv transfektion af protoplasterne 27.
Protoplasterne kan afbildes på enhver luminescerende imaging platform. I denne video har vi anvendt en luminescens-pladelæser udstyret med udvendige lys (rød og blå lysdioder, 630 og 470 nm, ved en kombineret intensitet på ~ 20 uE), som giver mulighed for high-throughput screening og hyppige målinger. Andre imaging udstyr, der registrerer luminescens, såsom alternative plade læsere eller opsætninger baseret omkring en charge-coupled device (CCD) kamera, kunne anvendes lige så godt, så længe belysning er til rådighed for fotosyntese. Fordelen ved at anvende et CCD-kamera monteret på en kontrollerbar kabinet er, at lys og temperatur kan programmeres. En ulempe er den længere capture tid, indføre lange perioder med mørke, som kan forårsage stress til protoplasterne foruden forstyrreing endogene tidtagning. Uanset hvilken eksperimentel platform er valgt, justering af indstillinger sandsynligvis være nødvendig i forhold til indstillingerne for kimplanter eller modne planter. Det er vores erfaring, kan øge koncentrationen af reporter plasmid under transfektion og / eller luciferin i imaging buffer løse eventuelle uregelmæssig eller hurtigt dæmpende rytmer, der måtte opstå i indledende forsøg.
I fremtidige eksperimenter, kan den her beskrevne metode anvendes til at studere circadian fænotype af enhver mutant Arabidopsis linje. Med mindre modifikationer, kan effekten af fx forskellige lægemidler på tidtagning studeres i denne opsætning. Endvidere kan transfektion modificeres til at inkludere kunstige microRNA til gen-silencing 19, yderligere udvidelse alsidigheden af denne protokol. Protokoller til at generere ris protoplaster er veletableret 29 og den billeddannende protokol præsenteres her kunne også anvendes til at fremme vores understanding af uret i økonomisk vigtige enkimbladede afgrøder.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Prof. David Somers and Dr. Jeongsik Kim for the luciferase reporter plasmid and initial method development. Prof. Karen Halliday kindly provided all the circadian mutant lines used in this study. This research was supported by Royal Society research grants RS120372 and RS140275. GvO is a Royal Society University Research Fellow (UF110173).
CELLULYSIN Cellulase, Trichoderma viride | Merck Millipore | 219466 | |
Pectinase R10 | Sigma Aldrich | P2401 | |
D-mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 | |
KCl | Sigma Aldrich | P3911 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A4503 | |
MES | Acros Organics | 327765000 | |
NaCl | Acros Organics | 327300010 | |
Glucose | Fischer Scientific | G/0500/60 | |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
Polyethylene glycol (PEG) 4000 | Acros Organics | 434630010 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F4135 | |
D-Luciferin, Firefly | Biosynth AG | L-8200 | Dissolve luciferin powder in 0.1M trisphosphate buffer pH 8.0 to a concentration of 50mM |
Ampicillin | Sigma Aldrich | A9618 | |
Comply Steam Indicator Tape | 3M | 1222 | |
Magic Tape | 3M | 819-1460 | |
Petri Dishes | Scientific Laboratory Supplies | SLS2002 | |
Microplate, 96 well, flat bottom, white | Greiner Bio-One | 655075 | |
TopSeal-A, adhesive lids for 96-well plates | Perkin Elmer | 6050195 | |
Syringe, 10 ml, w/o needle | BD Plastipak | 302188 | |
Syringe filter 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS) | Free download at amillar.org | ||
QIAfilter Maxiprep Kit | Qiagen | 12262 | |
Modified Fuch-Rosenthal counting chamber, double cell | Hawksley | AC6000 | |
Bright field microscope | Optika Microscopes | B-150POL-B | |
LB942 TriStar2 multimode reader, with luminescence module | Berthold Technologies Ltd | 57947/57948 |