Den biologiske klokke regulerer omtrent en tredjedel av Arabidopsis transkriptomet, men prosentandelen av gener som mates tilbake inn tidtakings er ukjent. Her visualisere en metode for raskt å vurdere circadian fenotyper i en hvilken som helst mutant linje av Arabidopsis ved hjelp av luminescerende avbildning av en cirkadisk reporter transient uttrykt i protoplaster.
The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.
De fleste levende organismer har en endogen tidtaker for å hjelpe effektiv forhandling av daglige endringer i miljøet. Dette timekeeper, biologiske klokke, regulerer mange aspekter av metabolismen og fysiologi av en organisme å forutse forutsigbare endringer i det ytre miljø. I planter for eksempel påvente av timelig forutsigbare patogen eller herbivore angrep sterkt reduserer generelle mottakelighet 1-4. Stivelse metabolisme er tett regulert av biologiske klokke for å sikre at stivelse reserver siste før daggry enten vokst på lange eller korte dag forhold 5. Faktisk, planter med biologiske klokka som samsvarer med 24-timers miljø viser økt vekstrater, karbonfikseringsrater og overlevelse sammenlignet med planter som kjører en klokke som ikke samsvarer perioden 6. Den omfattende innvirkning av cirkadianske rytmer i alle disse fremgangsmåter oppstår i stor utstrekning fra den rytmisk regulering av opptil en tredjedelav den totale transkriptomet i Arabidopsis 7. Disse rytmiske genprodukter involvert i et bredt spekter av cellulære prosesser, inkludert metabolske veier, hormon-signalering, og stressresponser 7. På toppen av det, er direkte biologiske regulering av protein funksjon etablert av circadian regulering av fosforylering 8 og mest sannsynligvis andre posttranslasjonelle modifikasjoner (PTMs).
I sentrum av den biologiske klokke som driver dette daglig transkripsjonen omprogrammering ligger et nettverk av transkripsjonen / translasjonell feedbacksløyfer (TTFLs), inkludert morgen-uttrykte gener biologiske klokke ASSOCIATED 1 (CCA1) og sen langstrakte hypocotyl (LHY) som undertrykke uttrykket av kvelden gener Tidspunkt for CAB 1 (TOC1), gigantea (GI) og medlemmer av kvelden kompleks (EF), LUX ARRHYTHMO (LUX), tidlig blomstring 3 (ELF3), og ELF4 9-11. sammen viddh pseudo RESPONSE regulator -genes (PRR3, 5, 7 og 9), undertrykker TOC1 CCA1 / LHY uttrykk mens EU fungerer som en positiv regulator 12-14. Tilleggs å tilbakekoblingsmekanismer, post-transcriptional og post-translasjonell regulering av TTFL nettverkskomponenter spiller en viktig rolle i tuning døgnrytme. Til dags dato den mest tallrike PTM identifisert på biologiske klokke proteiner er fosforylering 15. Fosforylering av CCA1 av kasein kinase 2 (CK2) påvirker dens binding til målet arrangører 16 og er viktig for temperaturkompensering av biologiske klokke 17. PRR proteiner fosforyleres forskjellig over døgnsyklus, og fosforylering av TOC1 påvirker samspillet med sin negative regulator, om kvelden-faset klokke komponent ZEITLUPE (ZTL) 18. Disse eksemplene illustrerer hvordan PTMs og protein-protein interaksjoner tune den TTFL nettverk inn i en 24-timerstranskripsjonen oscillator. For en mer detaljert innføring i transkripsjonen klokken nettverket og dets regulering, gode siste vurderingene er tilgjengelig (f.eks referanse 15).
Men det som er igjen mindre klart er i hvilken grad rytmisk regulerte prosesser og andre aspekter av cellenes stoffskifte mate tilbake til tidtaking mekanisme selv. Omfattende screening av Arabidopsis mutanter for klokkefeil kan få ytterligere forståelse av hvilke mekanismer eller signalveier kan være involvert i produksjon av 24-timers rytmer fra et TTFL nettverk. For dette formål, Kim og Somers tidligere publiserte et gjennombrudd fremgangsmåte for effektiv og rask analyse av klokkefunksjon i en hvilken som helst Arabidopsis linje 19. Basert på bruk av forbigående uttrykk i protoplaster, overgår denne metodikken behovet for stabile transgene linjer eller krysser til selvlysende klokke merkelinjer. Her visualiserer vi en høytytende protoplast isolation metode 20 kombinert med en optimalisert protokoll for å screene biologiske defekter ved selvlysende avbildning av transient uttrykt klokke markører i et 96-brønners plateleser.
Vi vil sammenligne villtype kolleger 0 Arabidopsis til godt karakterisert klokke mutanter å bekrefte metoden beskrevet her hell oppdager endrede døgnrytme. Protoplaster avledet fra disse linjene er tilført med en reporter konstruksjon som uttrykker ildflue luciferase fra circadian CCA1 arrangøren; CCA1pro: LUC 19. Luciferase katalyserer flertrinns reaksjon hvor luciferin omdannes til elektronisk spent oxyluciferin som avgir lys 21, som blir fotografert over tid for å vurdere periode, amplitude og fase av transkripsjonelle rytmer i disse protoplaster.
Protokollen består av tre hoveddeler; isolere protoplaster, trans de protoplaster med reporter plasmid, og selvlysende imaldring. Disse tre delene skal alltid utføres på en enkelt dag, ved hjelp av nylagde buffere og reagenser. Plantevekst og rensing av tilstrekkelige mengder av reporter plasmid bør utføres på forhånd, og er ikke anskueliggjort i denne protokollen.
Her presenterer vi en rask analyse for å screene circadian periode defekter i Arabidopsis linjer, inkludert protoplast isolasjon, transfeksjon, og luminecent bildebehandling. Circadian periode i villtype Arabidopsis og klokken mutanter cca1 / lhy, ZTL, og CCA1 -OX ble beregnet ut fra målinger av luminescens fra en CCA1pro: LUC reporter og funnet å være i samsvar med publiserte data generert fra hele planter som bruker mer tid- forbruker transgene tilnærminger (tabell 2). Ved hjelp av denne analysen for å screene Arabidopsis mutanter unngår den innledende krav for å generere transgene selvlysende linjer, noe som er tidkrevende og kan bare viser at en spesiell mutant viser villtype-rytmer. En klar fordel med denne protokollen er at enhver Arabidopsis linje kan bli vist i løpet av kort tid etter endrede circadian transkripsjons rytmer, som vil hjelpe identifisering av flere gener som påvirker tidtaking i planter.
<p class= "Jove_content"> Isolering av protoplaster kan være arbeidskrevende, spesielt hvis mutant Linjen viser et overskygget fenotype. Tidligere rapporterte fremgangsmåter for generering av protoplaster innebære skjæreblader eller stiklinger i tynne strimler og vakuum-infiltrering av strimler med enzymløsning for å tillate enzymer for å oppnå celleveggene 26,27. Den påfølgende spaltning krever minst 3 timers inkubering i mørket for å frigjøre protoplastene til enzym-oppløsningen. Når vakuum infiltrasjon ikke er brukt, er inkubasjonstiden opp til 18 timer anbefales. I den protokoll som presenteres her, er vakuum-infiltrering unødvendig fordi det epidermal cellelaget ugjennomtrengelig for enzymene blir fjernet ved tape. Ved generering av protoplaster ved å skjære plantemateriale er det nødvendig å skille protoplaster fra celleveggavfall etter fordøyelse; Dette blir vanligvis gjort ved å filtrere oppløsningen eller rense det på en sukker gradient 27,26. Her vil en hvilken som helst ufordøyd vev forblir på autoklaven båndet etterfordøyelse, så filtrering og sukker gradient rensing av protoplastene kan utelates. Det er en sjanse for at stress som følge av langvarig protoplasting prosedyrer påvirker celle levedyktighet og den biologiske klokke. Båndet baserte protoplasting metode 20 visualisert her gir et høyt antall protoplaster; og gitt levedyktigheten av celler i løpet av en cirkadisk tidsserie og de samsvarende perioden lengdene av protoplaster og hele planter (tabell 2), er metodikken som beskrevet her å foretrekke fremfor alternative metoder for å generere protoplaster.Transfeksjon trinn i protokollen er et kritisk punkt som virkninger på levedyktighet av protoplaster. Den PEG-oppløsning gjør det mulig for DNA som skal leveres inn i cellen, og både inkubasjonstid i denne oppløsning (trinn 3.4) og prosentandelen av PEG bør bestemmes empirisk. Den standard-konsentrasjonen er 20%, med lavere konsentrasjoner som reduserer transformasjonseffektivitet og høyerekonsentrasjoner reduserer levedyktighet 28. Inkubasjonstid så korte som fem minutter kan gi effektiv transfeksjon av protoplastene 27.
Protoplastene kan avbildes på en hvilken som helst selvlysende avbildning plattform. I denne videoen, har vi brukt en luminescens plateleser utstyrt med utvendige lys (rød og blå lysdioder, 630 og 470 nm, henholdsvis på en kombinert intensitet av ~ 20 μE), som gjør det mulig for high-throughput screening og hyppige målinger. Andre bildeutstyr som detekterer luminescens, for eksempel alternative plate lesere eller oppsett basert rundt en CCD (CCD) kamera, kan brukes like godt så lenge belysning er tilgjengelig for fotosyntese. Fordelen med å bruke et CCD-kamera montert på et styrbart kabinett er at lys og temperatur kan programmeres. En ulempe er den lengre opptakstid, innføring av lengre perioder med mørke som kan føre til stress til protoplastene i tillegg til å foruroligeing endogen tidtaking. Uansett hvilken eksperimentell plattform er valgt, vil trolig være nødvendig i forhold til innstillinger for planter eller modne planter justering av innstillinger. I vår erfaring, kan øke konsentrasjonen av reporter plasmid under transfeksjon og / eller luciferin i bildebufferen løse eventuelle feilaktige eller raskt demper rytmer som kan oppstå i innledende forsøk.
I senere eksperimenter, kan metoden beskrevet her bli anvendt for å studere circadian fenotypen til en hvilken som helst mutant Arabidopsis linje. Med mindre endringer, kan effekten av for eksempel ulike legemidler på tidtaking bli studert i dette oppsettet. Videre kan transfeksjon bli endret til å omfatte kunstig mikroRNA for genet stanse 19, ytterligere utvide allsidigheten til denne protokollen. Protokoller for å generere ris protoplaster er godt etablert 29 og bilde protokoll som presenteres her kan like gjerne brukes til å videreutvikle vår understanding av klokken i økonomisk viktige monocot kulturplanter.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Prof. David Somers and Dr. Jeongsik Kim for the luciferase reporter plasmid and initial method development. Prof. Karen Halliday kindly provided all the circadian mutant lines used in this study. This research was supported by Royal Society research grants RS120372 and RS140275. GvO is a Royal Society University Research Fellow (UF110173).
CELLULYSIN Cellulase, Trichoderma viride | Merck Millipore | 219466 | |
Pectinase R10 | Sigma Aldrich | P2401 | |
D-mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 | |
KCl | Sigma Aldrich | P3911 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A4503 | |
MES | Acros Organics | 327765000 | |
NaCl | Acros Organics | 327300010 | |
Glucose | Fischer Scientific | G/0500/60 | |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
Polyethylene glycol (PEG) 4000 | Acros Organics | 434630010 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F4135 | |
D-Luciferin, Firefly | Biosynth AG | L-8200 | Dissolve luciferin powder in 0.1M trisphosphate buffer pH 8.0 to a concentration of 50mM |
Ampicillin | Sigma Aldrich | A9618 | |
Comply Steam Indicator Tape | 3M | 1222 | |
Magic Tape | 3M | 819-1460 | |
Petri Dishes | Scientific Laboratory Supplies | SLS2002 | |
Microplate, 96 well, flat bottom, white | Greiner Bio-One | 655075 | |
TopSeal-A, adhesive lids for 96-well plates | Perkin Elmer | 6050195 | |
Syringe, 10 ml, w/o needle | BD Plastipak | 302188 | |
Syringe filter 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS) | Free download at amillar.org | ||
QIAfilter Maxiprep Kit | Qiagen | 12262 | |
Modified Fuch-Rosenthal counting chamber, double cell | Hawksley | AC6000 | |
Bright field microscope | Optika Microscopes | B-150POL-B | |
LB942 TriStar2 multimode reader, with luminescence module | Berthold Technologies Ltd | 57947/57948 |