A lungo termine ad alta risoluzione intravitale Microscopia nel polmone con un vuoto stabilizzato finestra Imaging
Summary
This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform long-term high-resolution, single cell imaging of the intact lung in real time using a vacuum stabilized imaging window.
Abstract
Metastasi a siti secondari come il polmone, fegato e osso è un evento traumatico con un tasso di mortalità di circa il 90% 1. Di questi siti, il polmone è il più difficile da valutare utilizzando imaging ottico intravitale grazie alla sua posizione chiusa all'interno del corpo, delicatezza e ruolo essenziale nel sostenere corretta fisiologia. Mentre le modalità cliniche (tomografia ad emissione di positroni (PET), la risonanza magnetica (MRI) e la tomografia computerizzata (CT)), sono in grado di fornire immagini non invasive di questo tessuto, non hanno la risoluzione necessaria per visualizzare i primi eventi di semina, con un singolo pixel composto da quasi un migliaio di cellule. I modelli attuali di metastasi polmonari semina postulato che gli eventi subito dopo l'arrivo di una cellula tumorale sono deterministico per la sopravvivenza e la successiva crescita. Ciò significa che in tempo reale strumenti di imaging intravitale con risoluzione singola cella 2 sono necessari per definire i fenotipi della cel seminaLS e testare questi modelli. Mentre l'imaging ottico ad alta risoluzione del polmone è stato eseguito utilizzando vari ex vivo i preparativi, questi esperimenti sono in genere saggi di tempo a punto singolo e sono suscettibili di manufatti e le possibili conclusioni errate a causa dell'ambiente drammaticamente alterato (temperatura, profusione, citochine, etc. ) risultante dalla rimozione dalla cavità toracica e sistema circolatorio 3. Studi recenti hanno dimostrato che il time-lapse imaging ottico intravitale del polmone intatto è possibile utilizzando un vuoto stabilizzato finestra di imaging 2,4,5 Tuttavia, i tempi tipici di imaging si sono limitati a circa 6 ore. Qui si descrive un protocollo per eseguire l'imaging intravitale time-lapse a lungo termine del polmone utilizzando tale finestra su un periodo di 12 ore. Le sequenze di immagini time-lapse ottenuti con questo metodo consentono la visualizzazione e la quantificazione delle interazioni cellula-cellula, la dinamica della membrana e perfusione vascolare nel polmone. Abbiamo inoltre dEscribe una tecnica di elaborazione di immagini che offre una visione senza precedenti chiara del microcircolo polmonare.
Introduction
Imaging ad alta risoluzione ottica intravitale ha dimostrato di essere fondamentale per comprendere molti processi biologici, permettendo a cella singola e parametri sub-cellulari da misurare e quantificare. Nella ricerca cancro, l'imaging intravitale delle cellule tumorali e stromali ha portato alla scoperta di molte interazioni microambientali 6-11 che sono presenti solo in animali intatti.
Scoperte circa microambienti associati intravasation e la diffusione delle cellule tumorali nel cancro al seno con l'imaging ottico risoluzione di singola cellula in vivo ha anche portato a nuovi marcatori per la prognosi e la risposta al trattamento in pazienti con cancro mammario 12-16. Le migliori tecnologie di imaging disponibili per la visualizzazione in profondità all'interno intatti gli organi vitali interni sono le modalità clinici (risonanza magnetica, PET, CT), che offrono una vista eccellente di tutta organo e possono rivelare patologie ancor prima che essi producono sintomi clinici. Non sono in grado, however, per rivelare le prime fasi di metastasi e dei meccanismi cellulari di guida progressione del tumore a causa della loro mancanza di risoluzione di singola cellula. Per il momento in metastasi polmonari sono visibili in queste modalità, sono ben stabiliti e proliferare. Data la stima che il 90% delle cellule disseminate tumorali che arrivano al polmone o non sopravvivono 17 o inizialmente rimangono dormienti 18, e l'osservazione che arrivano molto prima di quanto precedentemente previsto 19, l'imaging le prime fasi di arrivo e la sopravvivenza diventa cruciale per la comprensione del processo di semina metastatico e la ricorrenza della crescita tumorale in siti distanti.
L'esecuzione di queste osservazioni nel polmone si è dimostrato estremamente difficile tuttavia; la stragrande maggioranza degli studi di imaging hanno utilizzato ex vivo o espianto preparati 20-23, che solo danno una visione nei polmoni in momenti singoli. Mentre questi preparativi forniscono informazioni utilirmazioni, non danno una comprensione completa delle interazioni, rapporti di causa ed effetto, e dinamiche che si verificano tra i vari componenti del microambiente. La mancanza di un adeguato sistema circolatorio (e squilibrio concomitante di omeostasi) e la disconnessione dal resto del sistema immunitario del corpo rende desideravano convalidare le conclusioni che queste preparazioni generano nel tessuto intatto in vivo.
Molti gruppi hanno eseguito l'imaging intravitale del polmone intatto 2,4,5,24-33 con Wearn e tedesco essere il primo a chirurgicamente esporre lo strato pleurico 24 e Terry il primo a utilizzare una finestra di imaging impiantabile 25.
immagini ad alta risoluzione nel polmone è fortemente ostacolata dal movimento costante del polmone e diverse tecniche sono state sviluppate per superare questa limitazione. Wagner e Filley 27 hanno studiato il movimento naturale del polmone caninoe progettato loro protocollo chirurgico per localizzare loro finestra impiantato su una regione relativamente fisso mentre Wagner utilizzata vuoto nella sua finestra preparazione chirurgica per immobilizzare il tessuto 28. Da quel momento, una varietà di tecniche sono state utilizzate per l'immagine polmone tra cui: bloccaggio bronchi, apnea sequenziale e di imaging gated, acquisizione sovracampionato, incollaggio del lobo polmonare e aspirazione 34. Ognuno di questi ha i suoi vantaggi e svantaggi e nessuno tecnica è emerso come superiore ad un altro 34. Ad esempio, bronchi bloccaggio e apnea sequenziale alterano il normale scambio di gas nei polmoni e possono causare atelettasia. l'imaging Gated e l'acquisizione sovracampionato non soffrono di questi svantaggi, ma richiedono ad alta velocità o di apparecchiature di imaging specializzata non ampiamente accessibile. Infine sia incollaggio del polmone e la tecnica del vuoto evitare entrambi gli inconvenienti sopra citati, ma che possono mostrare lesioni forza indotta taglio se cura non è takit. Negli ultimi anni, la finestra di vuoto è stato miniaturizzato e adattato per l'uso nei topi utilizzando confocale e microscopia multifotonica 4,5,33 e eccellente imaging ad alta risoluzione è stato raggiunto 2. La tabella 1 riassume questa ricca storia ed esalta quelle carte che descrivono romanzo avanzamenti nella l'uso di finestre di imaging polmonare intravitale.
Questo protocollo descrive l'uso di prolungato time-lapse multiphoton intravitale microscopia a immagine di metastasi nel vivo, polmone intatto con la massima risoluzione possibile subcellulare. Le immagini sono acquisite fino a 12 ore utilizzando un microscopio multifotone dotato di elevata apertura numerica della lente obiettivo e rivelatori tubo fotomoltiplicatore multipla (PMT). modelli di topi transgenici sono utilizzati per etichetta fluorescente macrofagi native con fluorescente ad alta destrano peso molecolare e proteine transfettate cellule tumorali fluorescenti (per etichettare le cellule tumorali e sistema vascolare respectively). Anche se questa scelta di cellule fluorescente consente la visualizzazione delle interazioni cellula-macrofagi cellule endoteliali tumorali e le dinamiche, questo protocollo funziona per qualsiasi ceppo di topo fluorescenti o non fluorescente. Dopo l'acquisizione, il movimento residuo di deriva (se presente) viene eliminata con un plug-in Fiji 35,36 e personalizzati macro tempo medio del canale vascolare per eliminare lampeggiante causata da cellule del sangue circolanti senza etichetta.
Mentre questo protocollo concentra sull'imaging metastasi, le tecniche sono applicabili a molti altri processi biologici osservabili con l'imaging cella singola ad alta risoluzione nel polmone.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ad alta risoluzione in vivo imaging ottico in combinazione con le etichette funzionali fluorescente come proteine e anticorpi ha notevolmente aumentato la nostra comprensione della cascata metastatica. Ha permesso la visualizzazione diretta e la quantificazione di cella singola e parametri sub-cellulare nelle cellule tumorali, cellule ospiti e la loro microambiente. Questo l'imaging all'interno del tumore primario ha portato, ad esempio, alla scoperta di microambienti discreti, a sostegno di una invasio…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by NIH-CA100324, Einstein National Cancer Institute’s cancer center support grant P30CA013330, R01CA172451 to JWP and the Integrated Imaging Program. This technology was developed in the Gruss-Lipper Biophotonics Center and the Integrated Imaging Program at the Albert Einstein College of Medicine. We acknowledge the support of these Centers in this work. The authors thank Mike Rottenkolber, Ricardo Ibagon and Anthony Leggiadro of the Einstein machine shop for their skilled and timely craftsmanship, the laboratory of Matthew Krummel for generously sharing their window design drawings, Kevin Elicieri and Jeremy Bredfeldt for their expertise in microscopy and their amplifier recommendations and Allison Harney and Bojana Gligorijevic for informative discussions.
Materials
| Nickel-Plated Brass Vacuum Regulator 1/8 NPT Female, w/ Gauge, 0 – 20" Hg Vacuum | McMaster Carr | 4172K12 | Vacuum Regulator |
| Brass Barbed Hose Fitting Adapter for 1/4" Hose ID X 1/8" NPTF Male Pipe | McMaster Carr | 5346K13 | Vacuum Regulator Hose Adapter |
| Pyrex Brand Filtering Flasks with Tubulation; Neck tooled for rubber stopper No. 4; Capacity: 50mL | Corning Life Sciences Glass | 5360-50 | Vacuum Flask |
| Round Glass Coverslips Thickness #1.5, 0.16-0.19mm 10mm dia. | Ted Pella, Inc. | 260368 | Cover slips |
| Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters; 22gx1 in. | Exel International | 26746 | Tracheal Catheter |
| PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON LIGAPAK Dispensing Reel Size 2-0 | VWR | 95056-992 | String |
| Liquid Super Glue, Clear, 0.14oz | Hendel Corp. | LOC1647358 | Cyano-acrylate Glue |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | T1287-500MG | 155kD Dextran |
| Laboratory Clear Tygon PVC Tubing, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Wall Thickness, 25 ft. Length | McMaster Carr | 5155T12 | Thin Tubing & Tubing for Luer |
| Crack-Resistant Polyethylene Tubing, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Wall Thickness, White, 50 ft. Length | McMaster Carr | 5181K24 | Thick Tubing |
| Depillatory Lotion | Nair | – | |
| Micro Medical Tubing 95 Durometer LDPE | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/1 | Tubing for tail vein catheter |
| 30 G x 1 in. BD PrecisionGlide Needle | BD | 305128 | Needles for tail vein catheter |
| Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 867WCNOGLUE | |
| Clear Polycarbonate Barbed Tube Fitting, Reducing Straight for 3/32" x 1/16" Tube ID | McMaster Carr | 5117k51 | Connectors between tubes |
| One-Hole Rubber Stoppers | Fisher Scientific | 14-135F | Stopper for Vacuum Flask |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100µl | Denville Scientific Inc. | P1125 | Pipette Tip |
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Opthalmic Ointment |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery Pen |
| Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical | RS-5135 | Forceps |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24mm | Roboz Surgical | RS-5912 | Sharp Scissors |
| Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt | Roboz Surgical | RS-5980 | Blunt Scissors |
| Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Harness |
| PhysioSuite System | Kent Scientific | PhysioSuite | Vitals Monitor |
| 1 mL Syringe, Tuberculin Slip Tip | BD | 309659 | Syringe |
| Cyano acrylate | Staples | LOC1647358 | Cover Slip Adhesive |
| Petroleum Jelly | Fisher Scientific | 19-086291 | Water Barrier |
| Adapter Luer Cannulla 1.5-2.2mm | Harvard Apparatus | 734118 | Catheter Connector |
| MouseOx oximeter, software and sensors | STARR Life Sciences | MouseOx | Pulse Oximeter |
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | 250 mL |
| Oxygen | TechAir | OX TM | |
| 1 x PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| PVC Ball Valve, Push to Connect, 1/4 In | Grainger | 3CGJ7 | Vacuum Valve |
| Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 683 | Alternative is available from Kent Scientific: MouseVent |
| OptiMEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
| MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J Mice | Jackson Laboratory | 026051 | |
| Multiphoton Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | Alternative to custom built scope |
| Environmental Enclosure | Precision Plastics | Chamber for FV1000 | Alternative to custom built enclosure |
| Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190136 | |
| Laser Power Meter | Coherent | FieldMaxIITOP | |
| Laser Power Meter Head | Coherent | PM10 | |
| pcDNA3-Clover Fluorescent Protein Vector | Addgene | 40259 | |
| G418 Sulfate Selective Antibiotic | ThermoFisher Scientific | 10131027 | |
| MoFlo Fluorescent-Activate Cell Sorter | Beckman Coulter | XDP | |
| Trypsin EDTA 1X | Corning | 25-052-Cl | |
| 40 µm Mesh | Falcon | 352235 | |
| 96 Well Plate | Costar | 3599 | |
| 60 mm Culture Dish | Corning | 430196 | |
| 10 cm Culture Dish | Corning | 353003 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | Corning | 21-031-CV | |
| C57BL/6J Mouse | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A |
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