À long terme à haute résolution Microscopie intravitale dans le poumon avec un vide Stabilisé Imaging Window

Résumé

Ce protocole décrit l’utilisation de la microscopie multiphotonique pour effectuer une imagerie à long terme, à haute résolution, sur cellule unique, du poumon intact en temps réel à l’aide d’une fenêtre d’imagerie stabilisée sous vide.

Résumé

Métastase vers des sites secondaires , tels que le poumon, le foie et l' os est un événement traumatique avec un taux d'environ ¹ à 90% de mortalité. Parmi ces sites, le poumon est le plus difficile à évaluer en utilisant l'imagerie optique intravitale en raison de sa position fermée dans le corps, la nature délicate et rôle vital dans le maintien de la physiologie appropriée. Bien que les modalités cliniques (tomographie par émission de positons (TEP), l'imagerie par résonance magnétique (IRM) et de tomodensitométrie (CT)) sont capables de fournir des images non invasives de ce tissu, ils manquent de la résolution nécessaire pour visualiser les premiers événements d'ensemencement, avec un seul pixel constitué de près d'un millier de cellules. Les modèles actuels de poumon métastatique ensemencement postulat que les événements juste après l'arrivée d'une cellule tumorale déterministes pour la survie et la croissance ultérieure. Cela signifie que en temps réel des outils d'imagerie intravitale avec une résolution à une seule cellule ² sont nécessaires pour définir les phénotypes de l'ensemencement cells et de tester ces modèles. Alors que l' imagerie optique à haute résolution du poumon a été réalisée en utilisant divers ex vivo des préparations, ces expériences sont généralement seule fois-point des tests et sont sensibles à des artefacts et des conclusions erronées possibles en raison de l'environnement considérablement modifié (température, profusion, cytokines, etc. ) résultant de la suppression de la cavité thoracique et le système circulatoire ^3. Des travaux récents ont montré que l' imagerie optique intravitale time-lapse du poumon intact est possible en utilisant un vide stabilisé fenêtre d'imagerie ^2,4,5 cependant, les temps typiques d'imagerie ont été limités à environ 6 heures. Nous décrivons ici un protocole pour effectuer une imagerie intravitale time-lapse à long terme du poumon en utilisant une telle fenêtre sur une période de 12 heures. Les time-lapse séquences d'images obtenues à l'aide de cette méthode permettent la visualisation et la quantification des interactions entre les cellules, la dynamique des membranes et de la perfusion vasculaire dans les poumons. Nous avons en outre dEscribe une technique de traitement d'image qui donne une vue sans précédent claire de la microvascularisation pulmonaire.

Introduction

L'imagerie haute résolution optique intravitale est avérée être essentielle à la compréhension de nombreux processus biologiques, ce qui permet une seule cellule et des paramètres de sous-cellulaires qui doivent être mesurés et quantifiés. Dans la recherche sur le cancer, l' imagerie intravitale de cellules tumorales et stromales a conduit à la découverte de nombreuses interactions microenvironnementales ^6-11 qui ne sont présents que chez l'animal intact.

Les découvertes sur microenvironnements associés à intravasation et la diffusion des cellules tumorales dans le cancer du sein par imagerie optique à résolution ce....

Protocole

Toutes les procédures décrites dans ce protocole ont été réalisées conformément aux directives et réglementations relatives à l'utilisation des animaux vertébrés, y compris l'approbation préalable de l'Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care et utilisation Comité.

1. Génération de souris marquées par fluorescence des modèles et des cellules tumorales

1. Préparer 100 ml (p / v) de sérum-albumine bovine / tampon du tampon phosphate salin (PBS / BSA) à 0,1% en mélangeant 0,1 g de BSA avec 100 ml de PBS.
2. Préparer les cellules tumorales marquées par fluorescence par transfection stable.

Résultats

Pour démontrer le type de résultats qui peuvent être obtenus avec cette méthode, nous avons injecté des cellules tumorales E0771-LG étiquetés avec le Clover protéine fluorescente dans la veine de la queue de souris MacBlue ⁴⁴ à différents points de temps avant la chirurgie. Après la chirurgie, 155 kD rhodamine dextran marqué a été injecté par voie IV pour marquer la vascularisation et imagerie time-lapse a été réalisée.

Discussion

Haute résolution en imagerie optique in vivo combinée avec des étiquettes fonctionnelles marquées par fluorescence tels que des protéines et des anticorps a augmenté de façon spectaculaire notre compréhension de la cascade métastatique. Elle a permis la visualisation directe et la quantification d'une seule cellule et des paramètres de sous-cellulaire dans les cellules tumorales, des cellules hôtes et leur microenvironnement. Cette imagerie au sein de la tumeur primaire a conduit, par exemple, à la.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Régulateur de vide en laiton nickelé 1/8 NPT femelle, avec manomètre, 0 - 20" Hg Vide	McMaster Carr	4172K12  ;	Régulateur de vide
Adaptateur de raccord de tuyau cannelé en laiton pour tuyau 1/4 « ID x 1/8 » NPTF Tuyau mâle	McMaster Carr	5346K13	Régulateur de vide Adaptateur de tuyau
de marque Pyrex Fioles filtrantes avec tubulation ; Col usiné pour butée en caoutchouc n° 4 ; Contenance : 50 ml	Corning Life Sciences Glass	5360-50	Flacon à vide
Recouvrement rond en verre Épaisseur #1,5, 0,16 - 0,19 mm 10 mm de diamètre.	Ted Pella, Inc.	260368	Cathéters
jetables Exel International Safelet I.V., 22 g x 1 po.	Exel International	26746	Cathéter trachéal
PERMA-HAND Sutures en soie tressée noire, ETHICON LIGAPAK Bobine de distribution Taille 2-0	VWR	95056-992	String
Liquid Super Glue, Clair, 0,14 oz	Hendel Corp.	LOC1647358	Colle cyano-acrylate
Tétraméthylrhodamine isothiocyanate&ndash ; Dextran	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	155 kD
Laboratory, 1/16 » ID, 1/8 » OD, 1/32 » Épaisseur de paroi, 25 pi Longueur	McMaster Carr	5155T12	Tube mince et Tubes pour
tubes en polyéthylène résistant aux fissures Luer, 1/8 » ID, 1/4 » OD, 1/16 » d’épaisseur de paroi, blanc, 50 pieds de longueur.	McMaster Carr	5181K24  ;	Tube épais
Lotion dépilatoire		Nair-Micro
Medical Tubing 95 Duromètre LDPE	Scientific Commodities Inc.	BB31695-PE/1	Tubulure pour cathéter veineux de queue
30 G x 1 po. Aiguille BD PrecisionGlide	Aiguilles BD	305128	pour cathéter veineux de queue
Puritan Écouvillons non stériles à pointe de coton  ;	Fisher Scientific	867WCNOGLUE
Raccord de tube cannelé en polycarbonate transparent, droit réducteur pour tube de 3/32 » x 1/16 » ID	McMaster Carr	5117k51	Connecteurs entre les tubes
Bouchons en caoutchouc à un trou	Fisher Scientific	14-135F	Bouchon pour flasque à vide
SHARP Embouts de barrière de précision, pour P-100, 100 et micro ; l	Denville Scientific Inc.	P1125	Pointe de pipette
Bande de laboratoire	Fisher Scientific	159015R
Puralube	Henry Schein Santé animale	008897	Pommade ophtalmique
Gemini Cautery Kit	Harvard Apparatus	726067	Cautery
Pen Graefe Micro Dissection Forceps ; Dentelé; légère courbe ; Largeur de pointe de 0,8 mm ; 4" de longueur	Roboz Surgical	RS-5135  ;	forceps
Extra Fine Micro Ciseaux de Dissection 4 » Droite Sharp/Sharp 24 mm	Roboz Surgical	RS-5912	Ciseaux Tranchants
Micro Ciseaux de Dissection 4 » Droite Blunt/Blunt	Roboz Surgical	RS-5980	Ciseaux Blunt
	Fisher Scientific	06-666-A  ;	harnais
PhysioSuite System	Kent Scientific	PhysioSuite	Vitals Monitor
1 ml Seringue, tuberculine Slip Tip	BD	309659	Seringue
acrylate de cyanose	Agrafes	LOC1647358	Cover Slip Adhesive
Petroleum Jelly	Fisher Scientific	19-086291	de barrière d’eau
Luer Cannulla 1,5 - 2,2 mm	Appareil	Harvard734118	Connecteur de cathéter
PhysioSuite MouseOxymètre de pouls STAT	Oxymètre de pouls	Kent Scientific
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	250 ml
Oxygen	TechAir	OX TM
1x PBS	Life Technologies	10010-023
Vanne à bille en PVC, Push to Connect, 1/4 po	Grainger	3CGJ7	Vacuum Valve
Small Animal Ventilator	Harvard Apparatus	683	Alternative est disponible auprès de Kent Scientific : MouseVent
OptiMEM Reduced Serum Medium	ThermoFisher Scientific	31985062  ;
Lipofectamine 2000 Réactif de transfection	ThermoFisher Scientific	11668019
MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J	Mice Jackson	Laboratory 026051  ;
Microscope multiphotonique	Olympus	Fluoview FV1000	Alternative à la lunette sur mesure
Boîtier environnemental	Chambre en plastique de précision	pour FV1000	Alternative au boîtier sur mesure
Tampon au phosphate Saline	ThermoFisher Scientific	14190136
Capteur de puissance laser	Champ cohérentMaxIITOP
Tête de wattmètre laser	cohérente	PM10
pcDNA3-Clover Fluorescent Protein Vector	Addgene	40259
G418 Sulfate Selective Antibiotic	ThermoFisher Scientific	10131027
MoFlo Fluorescent-Activate Cell Sorter  ;	Beckman Coulter	XDP
Trypsine EDTA 1x	Corning	25-052-CL
40 µ ; m Mesh	Falcon	352235
96 Well Plate	Costar	3599
60 mm Plat de culture	Corning	430196
10 cm Plat de culture	Corning	353003
Albumine sérique bovine	Sigma-Aldrich	A4503
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1x	Corning	21-031-CV
C57BL/6J Souris	Jackson Laboratoire	000664  ;
Kim Wipes	Fisher Scientific	06-666-A  ;

Tube en PVC transparent Dextran Lingettes en Adaptateur