Langsiktig høy oppløsning intraMikros i Lung med et vakuum Stabilisert Imaging Window

Summary

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform long-term high-resolution, single cell imaging of the intact lung in real time using a vacuum stabilized imaging window.

Abstract

Metastaser til sekundære områder som lunger, lever og bein er en traumatisk hendelse med en dødelighet på ca 90% ^en. Av disse områdene, er det lunge den mest vanskelig å vurdere ved å bruke intra optisk avbildning på grunn av sin lukkede posisjon inne i legemet, skjøre natur og vital rolle i å opprettholde riktig fysiologi. Mens kliniske modaliteter (positronemisjonstomografi (PET), magnetisk resonans imaging (MRI) og computertomografi (CT)) er i stand til å tilby ikke-invasive bilder av dette vevet, de mangler den oppløsningen som er nødvendig for å visualisere de tidligste seeding arrangementer, med en enkelt piksel som består av nesten tusen celler. Aktuelle modeller av metastatisk lungesykdom seeding postulat at hendelser like etter en svulst celle ankomst er deterministisk for overlevelse og påfølgende vekst. Dette betyr at sanntidsintraavbildningsverktøy med enkelt celle oppløsning ² er nødvendig for å definere de fenotyper av seeding cells og teste disse modellene. Mens høy oppløsning optisk avbildning av lungen har blitt utført ved anvendelse av forskjellige ex vivo preparater, disse eksperimentene er typisk enkelt tids-punktprøvene, og er utsatt for artefakter og eventuelle feilaktige konklusjoner etter den dramatisk endret omgivelsene (temperatur, overflod, cytokiner, etc. ) som følge av fjerning fra brysthulen og sirkulasjonssystemet ^3. Nyere arbeider har vist at time-lapse intra optisk avbildning av det intakte lungen blir mulig ved hjelp av en vakuum stabilisert bildevinduet ^2,4,5 har imidlertid typisk bilde ganger vært begrenset til omtrent 6 timer. Her beskriver vi en protokoll for å utføre langtidsintra time-lapse avbildning av lungene anvendelse av et slikt vindu i løpet av en periode på 12 timer. Time-lapse bildesekvenser som oppnås ved hjelp av denne metoden gi visualisering og kvantifisering av celle-celle interaksjoner, membran dynamikk og vaskulær perfusjon i lungene. Vi videre describe et bildebehandlingsteknikk som gir en uhørt klar utsikt til lunge microvasculature.

Introduction

Høy oppløsning intra optisk avbildning har vist seg å være avgjørende for å forstå mange biologiske prosesser, slik at enkelt-celle og sub-cellulære parametre som skal måles og kvantifiseres. I kreftforskning har intravital avbildning av tumor og stromale celler førte til oppdagelsen av mange microenvironmental interaksjoner ^6-11 som bare er til stede i det intakte dyr.

Oppdagelser om microenvironments forbundet med intravasation og spredning av kreftceller i brystkreft ved hjelp av enkelt celle oppløsning optisk imaging in vivo har selv ført til nye markører for prognose og behandlingsrespons hos brystkreftpasienter ^12-16. De beste bildeteknologi tilgjengelig for visning dypt inne intakte indre vitale organer er de kliniske modaliteter (MRI, PET, CT) som tilbyr utmerket utsikt over hele organet og kan avsløre sykdommer selv før de produserer kliniske symptomer. De er ikke i stand, hsom fører til, for å avsløre de tidligste stadier av metastasering og de cellulære mekanismer som driver tumorutvikling på grunn av deres mangel på enkeltcelle-oppløsning. Etter den tid lungemetastaser er synlige i disse modaliteter, de er godt etablert og voksende. Gitt den anslår at 90% av disseminerte tumorceller som kommer til lungen heller ikke overlever ¹⁷ eller innledningsvis forbli hvil ^18, og den observasjon at de kommer langt tidligere enn tidligere antatt ^19, å avbilde de tidligste trinnene for ankomst og overlevelse blir avgjørende for å å forstå prosessen med metastatisk såing og tilbakefall av tumorvekst ved fjerntliggende områder.

Utføre disse observasjonene i lungen har vist seg svært vanskelig imidlertid; de aller fleste imaging studier har benyttet ex vivo eller eksplantering preparater ^20-23, som bare gir et blikk inn i lungene ved enkelt tidspunkter. Selv om disse preparatene kan gi oss nyttig infobekreftelse, de gir ikke en fullstendig forståelse av samspillet, årsak og virkning relasjoner, og dynamikken som oppstår mellom de ulike komponentene i mikromiljøet. Mangelen på en skikkelig sirkulasjonssystemet (og samtidig ubalanse av homeostase) og frakobling fra resten av kroppens immunsystem gjør det ønskelig å validere konklusjoner som disse preparatene genererer i intakt vev in vivo.

Mange grupper har utført intra avbildning av det intakte lunge ^2,4,5,24-33 med Wearn og tysk å være den første til å kirurgisk eksponere pleural lag ²⁴ og Terry den første til å utnytte en implanterbar bildevinduet ^25.

Høy oppløsning i lungen er sterkt hindret av lunge konstant bevegelse og flere teknikker har blitt utviklet for å overvinne denne begrensningen. Wagner og Filley ²⁷ studerte den naturlige bevegelse av canine lungeog utviklet sin kirurgiske protokollen til å finne sin implantert vindu over en relativt stasjonær region mens Wagner utnyttet vakuumet i vinduet hans kirurgisk forberedelse til å immobilisere vevet ^28. Siden den gang har en rekke teknikker blitt benyttet til bilde lungene inkludert: bronkie klem, sekvensiell apnea og gated bildebehandling, oversamples oppkjøp, liming av lungen lapp og vakuum ^34. Hver av disse har sine fordeler og ulemper, og ingen teknikk har dukket opp som bedre enn en annen ^34. For eksempel, bronkie klem og sekvensiell apné endre den normale utveksling av gasser i lungen, og kan føre til atelektase. Lukket bildebehandling og oversamples oppkjøpet ikke lider av disse ulempene, men krever høy hastighet eller spesialisert tenkelig utstyr ikke allment tilgjengelig. Endelig er både liming av lungen og vakuumteknikken unngå begge de ovennevnte ulemper, men kan utvise skjærkraft indusert skade hvis behandling er ikke takno. I de senere år har vakuum vinduet blitt miniatyrisert og tilpasset for bruk i mus ved hjelp av konfokal mikroskopi og multiphoton ^4,5,33 og utmerket høy-oppløsning avbildning er blitt oppnådd ^2. Tabell 1 oppsummerer denne rike historie og fremhever de papirer som beskriver nye fremskritt i bruk av intra lunge bilde vinduer.

Denne protokollen beskriver bruk av utvidede time-lapse multiphoton intravital mikroskopi av bildet metastaser i lever, lunge intakt med den høyeste subcellulære mulig oppløsning. Bildene er kjøpt for opp til 12 timer ved hjelp av en multiphoton mikroskop utstyrt med en høy numerisk apertur objektiv og flere fotomultiplikatorrør (PMT) detektorer. Transgene musemodeller anvendes for å fluorescerende merke opprinnelige makrofager sammen med fluoriserende høy molekylvekt, dekstran og fluorescerende protein transfekterte tumorceller (for å merke vaskulaturen og tumorceller hhv støttevalseney). Selv om dette valget av fluorescerende merkede celler muliggjør visualisering av tumorcelle-endotelial celle-makrofag-interaksjoner og dynamikk, vil denne protokollen fungere for en hvilken som helst stamme av fluorescerende eller ikke-fluorescerende mus. Etter oppkjøpet blir rest drift bevegelse (hvis noen) elimineres ved hjelp av en Fiji plugin ^35,36 og egendefinerte makroer tid gjennomsnittlig vaskulær kanal for å eliminere blinkende forårsaket av umerkede sirkulerende blodceller.

Selv om denne protokollen fokuserer på avbildningsmetastase, de teknikker som er anvendbare for mange andre biologiske prosesser observerbare med høy oppløsning encellet avbildning i lungen.

Protocol

Alle prosedyrer beskrevet i denne protokollen er utført i samsvar med retningslinjer og regler for bruk av virveldyr, inkludert godkjennelse fra Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care og bruk komité. 1. Generering fluorescensmerkede musemodell og tumorceller Fremstille 100 ml 0,1% (w / v) bovint serumalbumin / fosfat-bufret saltvann (BSA / PBS) buffer ved å blande 0,1 g av BSA med 100 ml PBS. Forbered fluorescensmerkede tumorceller ved stabil tr…

Representative Results

For å demonstrere hva slags resultater som kan oppnås med denne metoden, injisert vi E0771-LG tumorceller merket med fluorescerende protein Clover i halevenen av MacBlue mus 44 ved varierende tidspunkter før operasjonen. Etter operasjonen ble 155 kD rhodamine merket dekstran injisert IV for å markere blodkar og time-lapse bildebehandling ble utført. Når bildebehandling mus 24 timer etter injeksjon, enkeltcelle…

Discussion

Høy oppløsning in vivo optisk avbildning kombinert med fluorescensmerkede funksjonelle koder som proteiner og antistoffer har dramatisk økt vår forståelse av metastatisk kaskade. Det har gjort det mulig direkte visualisering og kvantifisering av enkelt-celle og sub-cellulære parametre i tumorceller, vertsceller og deres mikromiljø. Denne avbildning innenfor den primære svulsten har ført, for eksempel, til oppdagelsen av diskrete mikromiljøer som er støttende for enten vekst eller spredning invasjon <…

Materials

Nickel-Plated Brass Vacuum Regulator 1/8 NPT Female, w/ Gauge, 0 – 20" Hg Vacuum	McMaster Carr	4172K12	Vacuum Regulator
Brass Barbed Hose Fitting Adapter for 1/4" Hose ID X 1/8" NPTF Male Pipe	McMaster Carr	5346K13	Vacuum Regulator Hose Adapter
Pyrex Brand Filtering Flasks with Tubulation; Neck tooled for rubber stopper No. 4; Capacity: 50mL	Corning Life Sciences Glass	5360-50	Vacuum Flask
Round Glass Coverslips Thickness #1.5, 0.16-0.19mm 10mm dia.	Ted Pella, Inc.	260368	Cover slips
Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters; 22gx1 in.	Exel International	26746	Tracheal Catheter
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON LIGAPAK Dispensing Reel Size 2-0	VWR	95056-992	String
Liquid Super Glue, Clear, 0.14oz	Hendel Corp.	LOC1647358	Cyano-acrylate Glue
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	155kD Dextran
Laboratory Clear Tygon PVC Tubing, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Wall Thickness, 25 ft. Length	McMaster Carr	5155T12	Thin Tubing & Tubing for Luer
Crack-Resistant Polyethylene Tubing, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Wall Thickness, White, 50 ft. Length	McMaster Carr	5181K24	Thick Tubing
Depillatory Lotion	Nair	–
Micro Medical Tubing 95 Durometer LDPE	Scientific Commodities Inc.	BB31695-PE/1	Tubing for tail vein catheter
30 G x 1 in. BD PrecisionGlide Needle	BD	305128	Needles for tail vein catheter
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	867WCNOGLUE
Clear Polycarbonate Barbed Tube Fitting, Reducing Straight for 3/32" x 1/16" Tube ID	McMaster Carr	5117k51	Connectors between tubes
One-Hole Rubber Stoppers	Fisher Scientific	14-135F	Stopper for Vacuum Flask
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100µl	Denville Scientific Inc.	P1125	Pipette Tip
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R
Puralube	Henry Schein Animal Health	008897	Opthalmic Ointment
Gemini Cautery Kit	Harvard Apparatus	726067	Cautery Pen
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical	RS-5135	Forceps
Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24mm	Roboz Surgical	RS-5912	Sharp Scissors
Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt	Roboz Surgical	RS-5980	Blunt Scissors
Wipes	Fisher Scientific	06-666-A	Harness
PhysioSuite System	Kent Scientific	PhysioSuite	Vitals Monitor
1 mL Syringe, Tuberculin Slip Tip	BD	309659	Syringe
Cyano acrylate	Staples	LOC1647358	Cover Slip Adhesive
Petroleum Jelly	Fisher Scientific	19-086291	Water Barrier
Adapter Luer Cannulla 1.5-2.2mm	Harvard Apparatus	734118	Catheter Connector
MouseOx oximeter, software and sensors	STARR Life Sciences	MouseOx	Pulse Oximeter
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	250 mL
Oxygen	TechAir	OX TM
1 x PBS	Life Technologies	10010-023
PVC Ball Valve, Push to Connect, 1/4 In	Grainger	3CGJ7	Vacuum Valve
Small Animal Ventilator	Harvard Apparatus	683	Alternative is available from Kent Scientific: MouseVent
OptiMEM Reduced Serum Medium	ThermoFisher Scientific	31985062
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	ThermoFisher Scientific	11668019
MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J Mice	Jackson Laboratory	026051
Multiphoton Microscope	Olympus	Fluoview FV1000	Alternative to custom built scope
Environmental Enclosure	Precision Plastics	Chamber for FV1000	Alternative to custom built enclosure
Phosphate Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	14190136
Laser Power Meter	Coherent	FieldMaxIITOP
Laser Power Meter Head	Coherent	PM10
pcDNA3-Clover Fluorescent Protein Vector	Addgene	40259
G418 Sulfate Selective Antibiotic	ThermoFisher Scientific	10131027
MoFlo Fluorescent-Activate Cell Sorter	Beckman Coulter	XDP
Trypsin EDTA 1X	Corning	25-052-Cl
40 µm Mesh	Falcon	352235
96 Well Plate	Costar	3599
60 mm Culture Dish	Corning	430196
10 cm Culture Dish	Corning	353003
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A4503
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X	Corning	21-031-CV
C57BL/6J Mouse	Jackson Laboratory	000664
Kim Wipes	Fisher Scientific	06-666-A