الآلية الروبوتية الاستغناء عن تقنية لتوجيه السطحية وBioprinting من الخلايا
Summary
This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.
Abstract
توضح هذه المخطوطة إدخال ميزات التوجيه خلية تليها التسليم المباشر للخلايا إلى هذه الميزات في bioink هيدروجيل باستخدام نظام صرف الآلي الآلي. تم اختيار bioink خاص لأنها تتيح الخلايا الرواسب نحو والشعور الميزات. نظام صرف bioprints خلايا قابلة للحياة في bioinks هيدروجيل باستخدام احداهما بمساعدة رأس الطباعة. ومع ذلك، من خلال استبدال رأس الطباعة مع قلم شحذ أو مشرط، ونظام صرف يمكن أيضا أن تستخدم لخلق العظة الطبوغرافية من خلال النقش السطح. حركة القلم يمكن برمجتها في الخطوات من 10 ميكرون في X، Y والاتجاهات Z. كانت قادرة على توجيه الخلايا الجذعية الوسيطة، التأثير عليهم لاعتماد الصرف ممدود في محاذاة مع اتجاه أخاديد "أخاديد نمط. ويمكن تصميم الزخرفة باستخدام البرمجيات بالتآمر في خطوط مستقيمة، دوائر متحدة المركز، وموجات جيبية. في إجراء لاحق، الليفيتوقفت الانفجارات والخلايا الجذعية الوسيطة في 2٪ الجيلاتين bioink، لbioprinting في احداهما مدفوعة قذف رأس الطباعة. ثم طباعة bioink تحمل الخلية باستخدام نفس الإحداثيات المبرمجة المستخدمة في الحفر. كانت قادرة على الإحساس والتفاعل مع الميزات محفورا كما يتضح من التوجه ممدود على طول اتجاه الأخاديد محفورا الخلايا bioprinted.
Introduction
الزخرفة متعمدة من وضع الخلية تتيح تشكيل الثقافات التي تحاكي في الجسم الحي منظمة الخلوية 1. في الواقع، والبحث في التفاعل بين أنواع الخلايا متعددة يمكن أن يحصل على مساعدة تنظيم 2،3 وضع المكاني. معظم أنظمة الزخرفة تعتمد على إجراءات تعديل السطح لتعزيز أو منع التصاق الخلية مع خلية لاحقة ترسب السلبي. تقدم Bioprinting السيطرة المكانية والزمنية على توزيعات خلية 1. وبالإضافة إلى هذه الوظائف، وقد وصفت bioprinting باعتبارها وسيلة واضحة من الناحية الفنية وسريع وفعالة من حيث التكلفة لتوليد السقالات معقدة هندسيا 4. فإنه يستخدم تصميم البرمجيات الكمبيوتر ويسمح إدخال الخلايا في عملية التصنيع (4).
وقد نظم Bioprinting تصنيفها على أساس مبادئ عملها وفقا ليزر مقرها، على أساس النافثة للحبر أو قذف على أساس 4. وقد وصفت قذف bioprinting كما الواعدة لأنها تتيح للتصنيع التركيبات المنظمة من الأحجام ذات الصلة سريريا ضمن إطار زمني واقعي 4-6. يتم تنفيذ ذلك إما عن طريق الضغط الميكانيكي أو الخلفي قذف بمساعدة من تأثير الخلايا هيدروجيل bioink. في الطريقة المعروضة هنا، كان يعمل الضغط مرة أخرى. كما ذكرنا، يتم تسليم الخلايا في bioink cytocompatible. هذا bioink ينبغي أن تدعم إيصال الخلايا دون إنتاج إجهاد القص ضار، وتكون ذات اللزوجة الكافية للاحتفاظ سلامة التتبع المطبوعة، دون أن تنهار أو نشر (المشار إليها باسم "نزف الحبر") 7-10.
ومن المعروف أن تفاعل الخلايا مع سطحها ملتصقة في التأثير على سلوك الخلوية. تضاريس السطح يمكن التحكم في شكل الخلية، والتوجه 11، وحتى في النمط الظاهري. على وجه الخصوص، وقد ثبت تلفيق الأخاديد والقنوات للحثامتدت، مورفولوجيا ممدود على أنواع خلايا متعددة. تم العثور على اعتماد هذا التشكل للتأثير على النمط الظاهري للخلايا متعدد القدرات والمحفزة. على سبيل المثال، عندما الانحياز في الأخاديد، والخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) تظهر أدلة على التمايز نحو العضلية 12،13 وخلايا العضلات الملساء الوعائية اعتماد النمط الظاهري مقلص خلال الاصطناعية 10،14-17.
الخلية التوفيق بين القنوات أو الأخاديد يمكن أن تتولد على سطح البوليمر عبر عدد من الطرق، على سبيل المثال، عميق الحفر أيون رد الفعل، شعاع الالكترون الطباعة الحجرية، والطباعة بالليزر مباشرة، ليزر الفيمتو ثانية، ضوئيه والبلازما الحفر الجاف 18. هذه الطرق غالبا ما تستغرق وقتا طويلا، وتتطلب أجهزة معقدة، ويمكن أن يكون مقيدا في شكل نمط إنشاؤها. وبالإضافة إلى ذلك، فإنها لا مزامنة الزخرفة مع bioprinting وعدم السماح لcellularization فوري. مراقبة حركة coordinately لالآلينظام الاستغناء يمكن اتباع أنماط معقدة لترسب الحلول. نحن هنا لشرح كيف يمكن أن تستغل الحركة التي تسيطر عليها الميكروسكيل إلى خلق قنوات لتوجيه الخلية. ومرفق القلم شحذ أو مشرط لرأس الطباعة في مكان الحقنة قذف، ويمكن أن المعدات ثم احفر سطح البوليمر بتوجيه من البرنامج التآمر. يوفر طريقة براعة في تصميم نمط وينطبق على المواد البوليمرية التي يشيع استخدامها في الهندسة الحيوية مثل البوليسترين، PTFE، وpolycaprolactone. وكخطوة لاحقة لالنقش، وخلايا يمكن bioprinted مباشرة إلى الأخاديد خدش. كان bioink الجيلاتين المستخدمة هنا قادرة على حد سواء الحفاظ على التتبع وتسمح للخلايا المودعة ليشعر ملامح محفورا. وقد أظهرت الخلايا الجذعية الوسيطة bioprinted إلى أخاديد محفورة إلى استطال على طول لهم في خطوط متميزة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في خطوة حاسمة من هذا الإجراء هو التسليم bioprinting الفعلي للخلايا الجذعية بأنها عملية يجب أن تسمح الترسيب الخلية إلى الميزات، طباعة بدون تنتشر bioink / النزيف، وتقديم الخلايا دون القص موت الخلايا التوتر ولا يؤدي التمايز نحو النسب غير المرغوب فيها.
<p class="jove_content" style=";text-align:r…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work presented here is supported by the Singapore National Research Foundation under CREATE program (NRF-Technion): The Regenerative Medicine Initiative in Cardiac Restoration Therapy Research Program and by the Public Sector Funding (PSF) 2012 from the Science and Engineering Research Council (SERC) under the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR).
Materials
| Equipment | |||
| Robotic Dispensing System | Janome | 2300N | |
| Plasma Machine | Femto Science | Covance | |
| USB Microscope | |||
| Optical Microscope | Olympus | IX71 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Spreadsheet | Excel | Excel | |
| Printing Co-ordinate Software | Janome | JR C-Points | |
| Imaging Software | National Institutes of Health (NIH) | ImageJ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Stylus (Blade) | OLFA | AK-5 | |
| 5ml printing syringe | San-ei Tech | SH10LL-B | |
| 30G printing needle | San-ei Tech | SH30-0.25-B | |
| 1mm polystyrene sheets | Purchased locally | ||
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | ||
| Gelatin from porcine skin, Gel strength 300, Type A | Sigma Aldrich | 9000-70-8 | |
| αMEM | Invitrogen | 41061-029 | |
| Antibiotc antimycotic | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
| Red Fluorescent Protein Mesenchymal Stem Cells (RFP-MSCs) | Cyagen Biosciences Incorporation | RASMX-01201 |
References
- Ma, Z., Ringeisen , R. B., Spargo, J. B., Wu, K. P., et al. . Cell and Organ Printing. , 137-159 (2010).
- Kaji, H., Camci-Unal, G., Langer, R., Khademhosseini, A. Engineering systems for the generation of patterned co-cultures for controlling cell-cell interactions. Biochim Biophys Acta. 1810 (3), 239-250 (2011).
- Goubko, C. A., Cao, X. Patterning multiple cell types in co-cultures: A review. Materials Science and Engineering: C. 29 (6), 1855-1868 (2009).
- Pati, F., Jang, J., Lee, J. W., Cho, D. W., Yoo, J. J. . Essentials of 3D Biofabrication and Translation. , 123-152 (2015).
- Derby, B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 338 (6109), 921-926 (2012).
- Malda, J., et al. 25th anniversary article: Engineering hydrogels for biofabrication. Adv Mater. 25 (36), 5011-5028 (2013).
- Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
- Skardal, A., Yoo, J. J. . Essentials of 3D Biofabrication and Translation. , 1-17 (2015).
- Irvine, S. A., et al. Printing cell-laden gelatin constructs by free-form fabrication and enzymatic protein crosslinking. Biomed Microdevices. 17 (1), 16 (2015).
- Bhuthalingam, R., et al. A novel 3D printing method for cell alignment and differentiation. International Journal of Bioprinting. 1, 57-65 (2015).
- Curtis, A., Wilkinson, C. Topographical control of cells. Biomaterials. 18 (24), 1573-1583 (1997).
- Tay, C. Y., et al. Micropatterned matrix directs differentiation of human mesenchymal stem cells towards myocardial lineage. Exp Cell Res. 316 (7), 1159-1168 (2010).
- Tay, C. Y., et al. Bio-inspired micropatterned platform to steer stem cell differentiation. Small. 7 (10), 1416-1421 (2011).
- Li, H., et al. Direct laser machining-induced topographic pattern promotes up-regulation of myogenic markers in human mesenchymal stem cells. Acta Biomater. 8 (2), 531-539 (2012).
- Kolind, K., Leong, K. W., Besenbacher, F., Foss, M. Guidance of stem cell fate on 2D patterned surfaces. Biomaterials. 33 (28), 6626-6633 (2012).
- Agrawal, A., et al. Smooth Muscle Cell Alignment and Phenotype Control by Melt Spun Polycaprolactone Fibers for Seeding of Tissue Engineered Blood Vessels. International Journal of Biomaterials. 2015, (2015).
- Chang, S., et al. Phenotypic modulation of primary vascular smooth muscle cells by short-term culture on micropatterned substrate. PLoS One. 9 (2), e88089 (2014).
- Li, Y., et al. Engineering cell alignment in vitro. Biotechnol Adv. 32 (2), 347-365 (2014).
- Blaeser, A., et al. Controlling Shear Stress in 3D Bioprinting is a Key Factor to Balance Printing Resolution and Stem Cell Integrity. Adv Healthc Mater. 5 (3), 326-333 (2016).
- Nery, A. A., et al. Human mesenchymal stem cells: From immunophenotyping by flow cytometry to clinical applications. Cytometry Part A. 83A (1), 48-61 (2013).
- Guvendiren, M., Lu, H. D., Burdick, J. A. Shear-thinning hydrogels for biomedical applications. Soft Matter. 8 (2), 260-272 (2012).
- Markstedt, K., et al. 3D Bioprinting Human Chondrocytes with Nanocellulose-Alginate Bioink for Cartilage Tissue Engineering Applications. Biomacromolecules. 16 (5), 1489-1496 (2015).
- Kolesky, D. B., et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Adv Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
- Merceron, T. K., Murphy, S. V., Yoo, J. J. . Essentials of 3D Biofabrication and Translation. , 249-270 (2015).
- Carrow, J. K., Kerativitayanan, P., Jaiswal, M. K., Lokhande, G., Gaharwar, A. K., Yoo, J. J. . Essentials of 3D Biofabrication and Translation. , 229-248 (2015).
- Lee, K. V., Turksen, K., et al. . Bioprinting in Regenerative Medicine. , 33-66 (2015).
- Ozbolat, I. T., Hospodiuk, M. Current advances and future perspectives in extrusion-based bioprinting. Biomaterials. 76, 321-343 (2016).
- Li, M., Tian, X., Schreyer, D. J., Chen, X. Effect of needle geometry on flow rate and cell damage in the dispensing-based biofabrication process. Biotechnol Prog. 27 (6), 1777-1784 (2011).
- Nikkhah, M., Edalat, F., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. Engineering microscale topographies to control the cell-substrate interface. Biomaterials. 33 (21), 5230-5246 (2012).
- Khademhosseini, A., et al. Microfluidic patterning for fabrication of contractile cardiac organoids. Biomed Microdevices. 9 (2), 149-157 (2007).
- Chelli, B., et al. Neural cell alignment by patterning gradients of the extracellular matrix protein laminin. Interface Focus. 4 (1), 20130041 (2014).
- Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
- Béduer, A., et al. Engineering of adult human neural stem cells differentiation through surface micropatterning. Biomaterials. 33 (2), 504-514 (2012).
- Bian, W., Jackman, C. P., Bursac, N. Controlling the structural and functional anisotropy of engineered cardiac tissues. Biofabrication. 6 (2), 024109 (2014).
- Chen, P. Y., et al. Fabrication of large perfusable macroporous cell-laden hydrogel scaffolds using microbial transglutaminase. Acta Biomater. 10 (2), 912-920 (2014).
- Bertassoni, L. E., et al. Direct-write bioprinting of cell-laden methacrylated gelatin hydrogels. Biofabrication. 6 (2), 024105 (2014).
- Zhao, X., et al. 3D patterned substrates for bioartificial blood vessels – The effect of hydrogels on aligned cells on a biomaterial surface. Acta Biomater. 26, 159-168 (2015).
