研究のための方法論<em> B。枯草菌</em小分子バイオフィルム阻害剤を特徴付けるためのモデルとしての>バイオフィルム
Summary
This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.
Abstract
This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.
Introduction
多細胞細菌群集は、自然と人為的な環境で重要な役割を果たし、かつ有益であるか、または非常に有害であり得ます。これらの多細胞コロニーを、個々の細胞が自己生産細胞外ポリマー物質（EPS）マトリックス中に埋め込まれている前記バイオフィルムとして知られています。 EPSは強く、彼らが植民地化の表面に細胞を接着します。彼らは、機械的および化学的な力に対するシールドとして機能し、セルラー通信1を容易に 、隣接するセルの間の密接な接触を作成します。バイオフィルムは、細胞が高度に制御使用差別コミュニティ、と見ることができる、コミュニティ内だけでなく、種2-5全体で彼らの活動を調整するためのプロセスを画策。バイオフィルム状態への成長のプランクトン、自由生活モードからの移行は、多くの場合、発達過程と関連しています。良い例は、グラム陽性土壌細菌の枯草菌（Bacillus subtilis）、したがってundomeですsticated株は、バイオフィルム形成につながる発達段階を研究するための堅牢なモデル生物としての役割を果たす。この細菌では、運動性の細胞は、特殊なタスク4を実行目立つ多細胞構造に自分自身を整理します。細胞の一つのグループは、マトリックス・プロデューサーはエキソポリサッカライド6を分泌し 、アミロイドタンパク質TASA 7,8、および表面疎水性タンパク質BslA 9,10;これらの全ては、EPS 11-13の組み立てに参加しています。
自然と人為的ニッチでのバイオフィルムの豊かさと、彼らが引き起こす可能性が推定される致命的なダメージを考えると、それらの形成を防止するための方法を見つけることが急務です。小分子阻害剤は、バイオフィルム形成に関与する新たな調節経路、酵素および構造タンパク質の発見を補助し、それによって多コミュニティアセンブリの複雑なプロセスにおける洞察を促進することができます。 B.として枯草菌バイオのためのよく研究モデルであります成膜14,15は、様々なバイオフィルム阻害剤の効果を評価するために使用することができます。この研究は、小分子阻害剤に対するバイオフィルムの反応を評価するための主要な4つの基本的な方法に取り組みます。まず、これらの阻害剤はバイオフィルム特有の目標を持っていることを確認するために、バイオフィルム形成に及ぼす影響からプランクトンの成長への影響の分離が重要です。ほとんどの抗菌剤は、それらのプランクトン増殖期の細胞を標的とするが、バイオフィルムのライフスタイルをターゲット分子はまれです。プランクトンの成長に影響を及ぼさない分子は毒性がないとして加えて、彼らは抗生物質耐性変異体16に有利な選択圧を減らすことができます。バイオフィルムは、D-アミノ酸または他の特定の細胞壁干渉分子で処理した場合、例えば、それらは、いずれの乱れまたは分解が、これらの阻害剤は、軽度に浮遊成長12,17に影響を及ぼす。これとは対照的に、多くの抗生物質は劇的リットルで、プランクトンの成長を損ないますittleまたはバイオフィルム形成17に影響はありません。
第二に、小分子の効果を研究するための一貫性と堅牢な実験的な枠組みを確立することが重要です。我々は、小分子阻害剤の有効濃度範囲は、前培養条件およびこれらの小分子阻害剤の効果を研究するために使用される実験に感受性であったことを観察しました。各種レポート、Bを勉強特に浮遊細菌のバイオフィルム12,17-19 – 枯草菌は、D-アミノ酸がペリクルの形成を阻害する濃度範囲の変化を明らかにしました。ここに示された結果は、以下の要因が活性濃度範囲の差を考慮することを示唆している：前培養条件（後期静止20増殖期対対数12,17）、前培養の条件で使用される増殖培地は、（リッチ、定義された対未定義[ルリアブロス、LB] [グルタミン酸ナトリウム- グリセロール、MSgg]）、接種率、特に接種前に前培養培地を除去します。静的ペリクル成長の温度は、小分子阻害剤D-ロイシン、本研究で使用した代表D-アミノ酸の活性範囲においてそれほど重要な役割を示しました。
最後に、一度バイオフィルムは、特定のバイオフィルム阻害剤は、堅牢かつ有益な方法は、バイオフィルムのフィットネスにこれらの阻害剤の効果を特徴付けるために必要とされるで処理されます。ここでは、独立して小分子阻害剤の効果を特徴づけるための2つの方法が詳細に記載されている：（1）バイオフィルムコロニー中で単一細胞に作用し、抗菌剤に対する耐性。自由生活細菌21-23と比較した場合、バイオフィルム中の細胞は、典型的には、抗生物質に対してより耐性があります。この現象は多因子ですが、抗生物質の侵入を低減するためのEPSの能力は、多くの場合、魅力的な説明を24としました</suP>。この方法は、抗菌性物質への曝露後の予め確立されたバイオフィルム細胞の生存率を評価します。 （2）バイオフィルムコロニーアーキテクチャへの影響を、大から小スケールへ。バイオフィルムコロニーは、それらの三次元構造およびEPSの存在によって特徴付けられます。小スケール（μm）とし、走査型電子顕微鏡を利用して、細胞形態、バイオフィルムコロニー構造とEPSのアーキテクチャ及び存在量の変化が大きい（ミリメートル）から可視化することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
枯草菌フォーム堅牢で高度に構造化されたバイオフィルムの両方の液体中（ペリクル）と固体培地上（コロニー）。したがって、特定のバイオフィルム阻害剤の作用の様式を特徴付けるための理想的なモデル生物として働きます。固形培地に、細胞は、エッジに、中心から放射状にシワのようなペリクルにおいて明らかではない独特の機能を持ったものと多細胞構造を形成します。し…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Electron microscope imaging was conducted at the Electron Microscopy Unit of the Weizmann Institute of Science, supported in part by the Irving and Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging. This research was also supported by the ISF I-CORE grant 152/1, Mr. and Mrs. Dan Kane, Ms. Lois Rosen, by a Yeda-Sela research grant, by the Larson Charitable Foundation, by Ruth and Herman Albert Scholars Program for New Scientists, by the Ilse Katz Institute for Materials Sciences and Magnetic Resonance Research grant, by the Ministry of Health grant for alternative research methods, and by the France-Israel Cooperation – Maimonide-Israel Research Program. IKG is a recipient of the Rowland and Sylvia Career Development Chair.
Materials
| Luria Broth, Lennox | Difco | 240230 | |
| Bacto Agar | Difco | 214010 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma, 136.09 g/mol | P0662-500G | |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific, 174.18 g/mol | BP363-1 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Fisher Scientific, 209.27 g/mol | BP308-500 | |
| magnesium chloride hexahydrate | Merck, 203.30 g/mol | 1.05833.0250 | |
| calcium chloride anhydrous | J.T. Baker, 110.98 g/mol | 1311-01 | |
| manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma, 197.91 g/mol | 31422-250G-R | |
| iron(III) chloride hexahydrate | Sigma, 270.30 g/mo) | F2877-500G | |
| zinc chloride anhydrous | Acros Organics, 136.29 g/mol | 424592500 | |
| thiamine hydrochloride | Sigma, 337.27 g/mol | T1270-100G | |
| L-tryptophan | Fisher Scientific, 204.1 g/mol | BP395-100 | |
| L-phenylalanine | Sigma, 165.19 g/mol | P5482-100G | |
| L-threonine | Sigma, 119.12 g/mol | T8625-100G | |
| glycerol anhydrous | Bio-Lab Itd | 712022300 | |
| L-glutamic acid monosodium salts hydrate | Sigma, 169.11 g/mol | G1626-1KG | |
| D-leucine | Sigma, 169.11 g/mol | 855448-10G | |
| ethanol anhydrous | Gadot | 830000054 | |
| razor blade | Eddison | NA | |
| circular cellulose filter papers | Whatman, 90 mm | 1001-090 | |
| glutaraldehyde | EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in water | 16220 | |
| paraformaldehyde | EMS, 16% in water | 15710 | |
| sodium cacodylate | Merck, 214.05 g/mol | 8.2067 | |
| calcium chloride 2-hydrate | Merck, 147.02 g/mol | 1172113 | |
| stub-aluminium mount | EMS, sloted head | 75230 | |
| carbon adhesive tape | EMS | 77825-12 | |
| Shaker 37°C | New Brunswick Scientific Innowa42 | NA | |
| Centrifuge | Eppendorf table top centrifuge 5424 | NA | |
| Digital Sonifier, Model 250, used with Double Step Microtip | Branson | NA | |
| Incubator 30 °C | Binder | NA | |
| Incubator 23 °C | Binder | NA | |
| Filter System, 500 ml, polystyrene | Cornig Incorporated | NA | |
| Rotary Shaker – Orbitron Rotatory II | Boekel | NA | |
| S150 Sputter Coater | Edwards | NA | |
| CPD 030 Critical Point Dryer | BAL-TEC | NA | |
| Environmental Scanning Electron Microscope | XL30 ESEM FEG Philips (FEI) | NA |
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