Méthodologies pour l'étude<em> B. subtilis</em> biofilms comme un modèle pour Caractériser Inhibiteurs biofilm petites molécules

Summary

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Abstract

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Introduction

communautés bactériennes multi-cellulaires jouent un rôle important dans les milieux naturels et anthropiques, et peuvent être bénéfiques ou très néfaste. Ces colonies multicellulaires sont appelées biofilms, dans lequel les cellules individuelles sont noyées dans une (EPS) de la matrice extracellulaire des substances polymères auto-produites. Les EPS adhèrent fortement les cellules à la surface qu'ils colonisent. Ils servent de bouclier contre les forces mécaniques et chimiques et de créer un contact étroit entre les cellules voisines, ce qui facilite la communication cellulaire ^1. Un biofilm peut être considérée comme une communauté différenciée, où les cellules utilisent très réglementées, orchestré des processus pour coordonner leurs activités au sein de la communauté, ainsi que toutes les espèces ^2-5. La transition d'un planctoniques, mode libre-vie de la croissance à un état de biofilm est souvent associée à des processus de développement. Un bon exemple est la bactérie du sol Bacillus subtilis Gram positif, et donc un undómësouche sticated sert organisme modèle robuste pour étudier les étapes du développement menant à la formation de biofilm. Dans cette bactérie, cellules mobiles s'organisent en structures multicellulaires visibles qui effectuent des tâches spécialisées ^4. Un groupe de cellules, la matrice producteurs sécrètent exopolysaccharides ^6, la protéine amyloïde Tasa ^7,8, et la protéine de surface hydrophobe BSLA ^9,10; qui tous participent à l'assemblage des EPS ^11-13.

Compte tenu de l'abondance des biofilms dans des niches naturelles et anthropiques et les dommages mortels putative ils peuvent causer, il y a un besoin urgent de trouver des moyens de prévenir leur formation. Les inhibiteurs de petites molécules peuvent aider à la découverte de nouvelles voies de régulation, des enzymes et des protéines structurales impliquées dans la formation de biofilm, et promouvoir ainsi un aperçu des processus complexes de l'ensemble de la communauté multicellulaire. Comme B. subtilis est un modèle bien étudié pour la bioformation d' un film ^14,15, il peut être utilisé pour évaluer les effets de divers inhibiteurs de biofilm. Cette étude aborde quatre méthodes fondamentales qui sont essentielles pour évaluer la réponse des biofilms aux inhibiteurs de petites molécules. Tout d'abord, pour s'assurer que ces inhibiteurs ont une cible spécifique de biofilm, la séparation de l'effet sur la croissance planctonique de l'effet sur la formation de biofilm est critique. La plupart des agents antibactériens cellules cibles dans leur phase de croissance planctonique, mais des molécules qui ciblent le mode de vie de biofilm sont rares. En outre, en tant que molécules qui ne touchent pas la croissance planctonique ne sont pas toxiques, ils peuvent réduire la pression sélective favorisant des mutants résistants aux antibiotiques ^16. Par exemple, lorsque les biofilms sont traités avec des acides aminés D ou de certaines autres molécules de paroi interférant cellule, ils sont soit perturbés ou démontées, mais ces inhibiteurs affectent seulement légèrement ^12,17 croissance planctonique. En revanche, de nombreux antibiotiques altèrent considérablement la croissance planctonique, avec little ou pas d' effet sur la formation de biofilm ^17.

Deuxièmement, l'établissement d'un cadre expérimental cohérente et solide pour étudier l'effet des petites molécules est cruciale. Nous avons observé que la plage de concentration active d'inhibiteurs de petites molécules est sensible aux conditions de préculture et le dispositif expérimental utilisé pour étudier l'effet de ces inhibiteurs à petites molécules. Divers rapports, en particulier ceux qui étudient B. subtilis, a révélé des variations dans la plage de concentration à laquelle les acides D-aminés inhibent la formation de pellicules – les biofilms bactériens flottants ^12,17-19. Les résultats présentés ici suggèrent que les facteurs suivants expliquent les différences dans la gamme de concentration active: les conditions de pré-culture (logarithmique ^12,17 par rapport à la phase tardive stationnaire ²⁰ croissance), le milieu de croissance utilisé dans l'état pré-culture (riche, undefined [Luria Broth, LB] par rapport défini [glutamate monosodique-glycérol, MSgg]), le rapport d'inoculation et en particulier l'élimination du milieu de pré-culture avant l'inoculation. La température de croissance pelliculaire statique a montré un rôle moins important dans le domaine d'activité de l'inhibiteur de petite molécule de D-leucine, représentant un acide D-aminé utilisé dans la présente étude.

Enfin, une fois que les biofilms sont traités avec des inhibiteurs de biofilm spécifiques, des méthodes robustes et informatives sont nécessaires pour caractériser les effets de ces inhibiteurs sur biofilm fitness. Ici, deux méthodes pour caractériser de façon indépendante l'effet des inhibiteurs de petites molécules sont décrits en détail: (1) L'effet sur des cellules individuelles au sein d'une colonie du biofilm et leur résistance aux agents antimicrobiens. Les cellules dans les biofilms sont généralement plus résistantes aux antibiotiques par rapport à des bactéries vivant librement ^21-23. Bien que ce phénomène est multifactorielle, la capacité des EPS pour réduire la pénétration des antibiotiques a souvent été considérée comme une explication attrayante ²⁴ </sup>. Cette méthode évalue la survie des cellules pré-établies biofilm après exposition à des substances antibactériennes. (2) L'effet sur l'architecture biofilm de la colonie, de la grande à la petite échelle. les colonies biofilm se caractérisent par leur structure tridimensionnelle et la présence de l'EPS. En utilisant la microscopie électronique à balayage, des changements dans la morphologie cellulaire, la structure de la colonie du biofilm et l'architecture et l'abondance de l'EPS peut être visualisée à partir de la grande taille (mm) à la petite échelle (um).

Protocol

1. Évaluation de l'effet des inhibiteurs de petites molécules sur Pellicle et formation de biofilms Colony Préparer une solution de 2 x milieu défini inducteur MSgg biofilm 25 sans que le chlorure de calcium et de fer (III) hexahydraté. Après stérilisation du filtre, ajouter le chlorure de calcium. Le milieu est prêt à être utilisé directement ou il peut être conservé à 4 ° C dans l'obscurité. Préparer la dilution 1x MSgg le jour de l'expérience. Dil…

Representative Results

Le dosage de la pellicule est une méthode pour étudier les processus hautement réglementés et dynamiques de B. multicellularité subtilis. En outre, le dosage de la pellicule est adapté pour tester une gamme de conditions soit pré-démarrage ou des concentrations de petites molécules dans une plaque multiple à la culture cellulaire unique dans une expérience. Cependant, B. la formation pelliculaire subtilis est sensible aux conditions de pré-culture (par exemple, le…

Discussion

Biofilms de Bacillus subtilis formes robustes et très structurés dans les deux liquides (pellicules) et sur un milieu solide (colonies). Par conséquent, il sert d'organisme modèle idéal pour caractériser le mode d'action des inhibiteurs de biofilm spécifiques. Sur un support solide, les cellules forment une structure multicellulaire présentant des caractéristiques distinctives qui ne sont pas évidents dans des pellicules, telles que les rides rayonnant à partir du centre vers le bord. Ainsi, …

Materials

Luria Broth, Lennox	Difco	240230
Bacto Agar	Difco	214010
potassium phosphate monobasic	Sigma, 136.09 g/mol	P0662-500G
potassium phosphate dibasic	Fisher Scientific, 174.18 g/mol	BP363-1
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid	Fisher Scientific, 209.27 g/mol	BP308-500
magnesium chloride hexahydrate	Merck, 203.30 g/mol	1.05833.0250
calcium chloride anhydrous	J.T. Baker, 110.98 g/mol	1311-01
manganese(II) chloride tetrahydrate	Sigma, 197.91 g/mol	31422-250G-R
iron(III) chloride hexahydrate	Sigma, 270.30 g/mo)	F2877-500G
zinc chloride anhydrous	Acros Organics, 136.29 g/mol	424592500
thiamine hydrochloride	Sigma, 337.27 g/mol	T1270-100G
L-tryptophan	Fisher Scientific, 204.1 g/mol	BP395-100
L-phenylalanine	Sigma, 165.19 g/mol	P5482-100G
L-threonine	Sigma, 119.12 g/mol	T8625-100G
glycerol anhydrous	Bio-Lab Itd	712022300
L-glutamic acid monosodium salts hydrate	Sigma, 169.11 g/mol	G1626-1KG
D-leucine	Sigma, 169.11 g/mol	855448-10G
ethanol anhydrous	Gadot	830000054
razor blade	Eddison	NA
circular cellulose filter papers	Whatman, 90 mm	1001-090
glutaraldehyde	EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in water	16220
paraformaldehyde	EMS, 16% in water	15710
sodium cacodylate	Merck, 214.05 g/mol	8.2067
calcium chloride 2-hydrate	Merck, 147.02 g/mol	1172113
stub-aluminium mount	EMS, sloted head	75230
carbon adhesive tape	EMS	77825-12
Shaker 37°C	New Brunswick Scientific Innowa42	NA
Centrifuge	Eppendorf table top centrifuge 5424	NA
Digital Sonifier, Model 250, used with Double Step Microtip	Branson	NA
Incubator 30 °C	Binder	NA
Incubator 23 °C	Binder	NA
Filter System, 500 ml, polystyrene	Cornig Incorporated	NA
Rotary Shaker – Orbitron Rotatory II	Boekel	NA
S150 Sputter Coater	Edwards	NA
CPD 030 Critical Point Dryer	BAL-TEC	NA
Environmental Scanning Electron Microscope	XL30 ESEM FEG Philips (FEI)	NA