В Vivo Изучение человеческого взаимодействия Эндотелиальная-перицитов Использование гелевой матрицы штепсельной вилки пробирного мыши

Summary

Мы представляем протокол для изучения взаимодействия эндотелиальной-перицитов человека в мыши с помощью изменения гелевой матрицы плагин ангиогенеза анализа.

Abstract

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

Introduction

Ангиогенез представляет собой процесс , посредством которого образуются новые кровеносные сосуды из предварительно существующей сосудистой сети ¹ и является предметом текущих исследований во многих областях , начиная от нормального развития болезни. Этот динамический процесс включает пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток (ЭКС) и набор перицитов построить сосудистую трубку, которая направлена в сторону участка , который нуждается в кислороде и доставку питательных веществ ^2. Для изучения этого процесса требует столь же динамический анализ, самое главное тот, который может резюмировать трехмерную природу формирования трубки. В пробирке 3D матричные анализы были разработаны для удовлетворения этой потребности и работали хорошо , чтобы позволить исследователям определить дискретные шаги в пространстве и времени , в котором ангиогенез имеет место ^{3, 4, 5, 6.} Тем не менее, эти модели в пробирке 3D матрицы ограничиваются изучением не-перфузию сосудов наd поэтому не имеют критических компонентов , имеющих отношение к процессу ангиогенеза (например, циркулирующей роста и ингибирующие факторы, неестественное напряжение / силы через сосудистого русла) и не в состоянии смоделировать сложную среду , присутствующей в живой ткани. Для устранения этого ограничения, несколько в естественных условиях анализов ангиогенеза были разработаны ^7, включая пробки анализа матрицы геля , которая будет находиться в центре нашего доклада ^{8, 9.}

Анализ гелевая матрица штепсель хорошо налаженные естественных условиях ангиогенез анализа в который обращается к исследователям , поскольку она обеспечивает надежную платформу для тестирования роли различных клеток и веществ в ангиогенеза. Матрица гель представляет собой коммерчески доступный раствор базальная мембрана, которая секретируется Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) линии клеток мыши саркомы, которая затвердевает в виде материала гелеобразную при 37 ° С. Гель матрица может быть смешана с клетками и / или веществ, таких как факторы роста, а также ИнджеИДКТК подкожно в мышь. Хозяин КЭ вторгнутся пробку в течение 14 дней, образуют сосудистую сеть, и стать перфузии кровью хозяина. На сегодняшний день, подключаемые анализы матрицы геля были сосредоточены исключительно на изучении поведения эндотелиальных клеток во время ангиогенеза, однако, насколько нам известно, никаких усилий не было сделано, чтобы определить, является ли этот анализ может быть использован для совместного культивирования эндотелиальных клеток и перицитов изучить, каким образом эти два типа клеток взаимодействуют во время ангиогенеза. В частности, понимание взаимосвязи между КЭ и перицитов является ценным для изучения заболеваний , где потеря кровеносных сосудов патологическое, в том числе микрососудистой ишемии и болезни периферических сосудов ^{10, 11, 12.}

Здесь мы опишем протокол, который вводит человека полученный перицитов к смеси гелевой матрице наряду с человеческим КЧС и фактор роста фибробластов (bFGF). Затем эту смесь можно вводить подкожно яп спинке мышей SCID, чтобы обеспечить образование полностью функциональным, перицитов покрытием, гибридные сосуды. Наш протокол описывает, как подготовить матрицу геля пробки, содержащие человеческие ECs с или без человеческих перицитов, помещение в SCID мышей и как анализировать гистологических срезов для критических ангиогенеза конечных точек.

Protocol

Этика Заявление: Процедуры с участием субъектов животных были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета в Стэнфордском университете в Школе медицины. ПРИМЕЧАНИЕ: Животные находятся под обезболиванием с 3% изофлуран испарителя и поставки газа O 2 3%. Использован?…

Representative Results

Представитель H & E и иммунофлуоресцентного окрашивание срезов матрицы геля зажигания показаны на рисунке 2. Разделы от ЕК только штекеры отображения некоторых судов, которые в большинстве случаев не озарен крови (рис 2 в левом верхнем углу черные с?…

Discussion

Анализ гель плагин матрица оказалась удобной и мощный метод для оценки регуляции генов в ангиогенезе, ангиогенеза и антиангиогенных соединений в естественных условиях, и дополнить тесты в лабораторных условиях . Здесь мы опишем подробно новый матричный гель плагин анализа ч…

Materials

PBS (Phosphate buffered saline)	Corning	21-031-CV
0.25% Trypsin/0.53mM EDTA	Corning	25-053-CI
Endothelial Cell Media (ECM) kit	Sciencell	1001	includes media, EC growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
Pericyte Media (PM) kit	Sciencell	1201	includes media, Pericyte growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
primary human pulmonary microvascular endothelial cells	Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative		this cell type is also available commercially. Cells used at passage 1-4
primary human pulmonary pericytes	Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative		this cell type is not available commercially, but brain paricytes are.  Cells used at passage 1-4
bFGF (basic Fibroblast Growth Factor)	Peprotech	100-18B	stock solution is 50ug/ml in 0.1% BSA in PBS, aliquots at 50 uL and stored at -20 degrees
Matrigel Basement Membrane Matrix	BD	356237
28G 1cc Insluin Syringe	BD	329410
SCID (Severe Combined Immune Deficiency) mice	The Jackson Laboratory	5557	NOD.SCID IL2R gamma knockout strain is the best strain; 4-6 weeks of age
1.5mL microcentrifuge tubes, sterile	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
15 mL screw top tubes, sterile	BD Biosciences	352096
PAP pen	Life Technologies	8899
hemocytometer	ThermoFisher Scientific	02-671-6
Nair hair removal cream	Walmart
anti-human CD31 primary antibody	LifeSpan Biosciences	LS-B4737	working solution is 1:50
anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibody	Sigma	C6198	working solution is 1:300
goat anti-rabbit secondary antibody; 488/green	ThermoFisher Scientific	A-11008	working solution is 1:250
Prolong Gold DAPI solution	Cell Signaling	8961S
microscope slides	VWR	48300-047
no. 1.5 cover slips	Thermo Fisher Scientific	12-544-D
citrate buffer 10x	Millipore	21545
extra fine surgical scissors	Fine Science Tools	14084-08
Formalin (paraformaldehyde)	Thermo Fisher Scientific	245-685
Tissue cassettes	Simport	M492-12
goat serum	Dako	X0907