In vivo-studie av Human Endothelial-Pericyte interaktion med hjälp av Matrix Gel Plug-analys i mus

Summary

Vi presenterar ett protokoll för att studera mänskliga endotel-pericyte interaktioner i musen med en variation av matris gel kontakten angiogenes analys.

Abstract

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

Introduction

Angiogenes är den process genom vilken nya blodkärl bildas från ett befintligt vaskulära nätverket ¹ och är i fokus för pågående forskning inom många områden som sträcker sig från normal utveckling till sjukdomen. Denna dynamiska process involverar proliferation och migration av endotelceller (ECS) och rekrytering av pericyter att konstruera en vaskulär rör som är riktad mot den plats som behöver syre och näringstillförsel ^2. För att studera denna process kräver en lika dynamisk analys, framför allt en som kan sammanfatta den tredimensionella karaktären av röret bildning. In vitro 3D matrisanalyser har utvecklats för att tillgodose detta behov och har fungerat bra för att tillåta forskare att definiera diskreta steg i tid och rum där angiogenes sker ^{3, 4, 5, 6.} Men dessa in vitro 3D matrismodeller begränsad till att studera icke-perfusion fartyg end saknar därför kritiska komponenter som är relevanta för angiogenesprocessen (t.ex. cirkulerande tillväxt och hämmande faktorer, onaturlig spänning / krafter över kärlbädden) och misslyckas med att simulera den komplexa miljö som finns i levande vävnad. Att ta itu med denna begränsning har flera in vivo angiogenesanalyser utvecklats ^7, inklusive matrisgel kontakten analys som kommer att vara i fokus för vår rapport ^{8, 9.}

Matrisen gel plug-analysen är en väletablerad in vivo angiogenesanalys som tilltalar forskare eftersom det ger en robust plattform för att testa roller olika celler och ämnen i angiogenes. Matrisgel är ett kommersiellt tillgängligt basalmembran-lösning som utsöndras av Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mus sarkom-cellinje som stelnar till en gel-liknande material vid 37 ° C. Matrisen gel kan blandas med celler och / eller substanser, såsom tillväxtfaktorer och Injected subkutant i musen. Värd EC invaderar kontakten under 14 dagar, bildar en vaskulär nätverk, och blir perfusion med värdens blod. Hittills har matris gel plug-analyser fokuserat på studier av endotelceller beteende under angiogenes, dock, såvitt vi vet inga ansträngningar har ännu gjorts för att avgöra om denna analys kan användas för att co-kultur endotelceller och pericyter att studera hur dessa två celltyper samverkar under angiogenes. Specifikt är värdefull för att studera sjukdomar där blodkärl förlust är patologisk, inklusive mikrovaskulära ischemi och perifer kärlsjukdom ^{10, 11, 12} förstå sambandet mellan EC och pericyter.

Här beskriver vi ett protokoll som introducerar pericyter humant ursprung till matrisen gelblandningen tillsammans med mänsklig EC och fibroblasttillväxtfaktor (bFGF). Denna blandning kan sedan injiceras subkutant in ryggen på SCID-möss för att möjliggöra bildandet av fullt fungerande, pericyte belagda, hybrid fartyg. Vår protokoll beskriver hur man förbereder matris gel pluggar innehållande humana EC antingen med eller utan mänskliga pericyter, placering i SCID-möss och hur man kan analysera histologiska sektioner för kritiska angiogenes ändpunkter.

Protocol

Etik uttalande: Rutiner som involverar djurförsök har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid Stanford University School of Medicine. OBS: Djur är under bedövning med 3% förångare isofluran och 3% leverans av O2 gas. Användning av veterinär salva på ögonen kan bidra till att förhindra torrhet under narkos. 1. Cellberedning Väx humana endotelceller och pericyte cellkulturer i 100 mm plattor med 10 ml av den lämpliga media. Ersätt 10 ml fär…

Representative Results

Representant H & E och immunofluorescerande färgning av matris gel plug sektioner visas i Figur 2. Avsnitten från EG bara pluggar visa vissa fartyg som oftast inte perfuserade med blod (Figur 2 uppe till vänster, svarta pilar) medan pluggar som innehåller både EC och pericyter visar flera perfunderad fartyg med större diameter och fullständig pericyte täckning, vilket framgår av positiv SMA färgning i direkt anslutning till CD31-positiva EC…

Discussion

Matrisen gel plug-analys har visat sig vara en praktisk och kraftfull metod för att utvärdera genreglering i angiogenes, angiogena och antiangiogena föreningar in vivo, och att komplettera in vitro-tester. Här beskriver vi i detalj en ny matris gel plug-analys av humant angiogenes som undersöker samspelet mellan endotelceller och pericyter under kärlbildningen.

Det finns några nya och viktiga steg i detta protokoll. Celler i låg passage (passage 1-4) är att föredr…

Materials

PBS (Phosphate buffered saline)	Corning	21-031-CV
0.25% Trypsin/0.53mM EDTA	Corning	25-053-CI
Endothelial Cell Media (ECM) kit	Sciencell	1001	includes media, EC growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
Pericyte Media (PM) kit	Sciencell	1201	includes media, Pericyte growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
primary human pulmonary microvascular endothelial cells	Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative		this cell type is also available commercially. Cells used at passage 1-4
primary human pulmonary pericytes	Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative		this cell type is not available commercially, but brain paricytes are.  Cells used at passage 1-4
bFGF (basic Fibroblast Growth Factor)	Peprotech	100-18B	stock solution is 50ug/ml in 0.1% BSA in PBS, aliquots at 50 uL and stored at -20 degrees
Matrigel Basement Membrane Matrix	BD	356237
28G 1cc Insluin Syringe	BD	329410
SCID (Severe Combined Immune Deficiency) mice	The Jackson Laboratory	5557	NOD.SCID IL2R gamma knockout strain is the best strain; 4-6 weeks of age
1.5mL microcentrifuge tubes, sterile	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
15 mL screw top tubes, sterile	BD Biosciences	352096
PAP pen	Life Technologies	8899
hemocytometer	ThermoFisher Scientific	02-671-6
Nair hair removal cream	Walmart
anti-human CD31 primary antibody	LifeSpan Biosciences	LS-B4737	working solution is 1:50
anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibody	Sigma	C6198	working solution is 1:300
goat anti-rabbit secondary antibody; 488/green	ThermoFisher Scientific	A-11008	working solution is 1:250
Prolong Gold DAPI solution	Cell Signaling	8961S
microscope slides	VWR	48300-047
no. 1.5 cover slips	Thermo Fisher Scientific	12-544-D
citrate buffer 10x	Millipore	21545
extra fine surgical scissors	Fine Science Tools	14084-08
Formalin (paraformaldehyde)	Thermo Fisher Scientific	245-685
Tissue cassettes	Simport	M492-12
goat serum	Dako	X0907