حمل كاملة ورم التجديد من مجافي الفم المنفخة من البحر شقائق النعمان النجيم<em> Nematostella vectensis</em
Summary
Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.
Abstract
الكائنات المجوفة، وعلى وجه التحديد هيدرا، كانت أول الحيوانات أظهرت لتجديد الهياكل التالفة أو المقطوعة، وبالفعل مثل هذه الدراسات أطلقت القول التحقيق البيولوجية الحديثة من خلال عمل Trembley منذ أكثر من 250 عاما. في الوقت الحاضر وقد شهدت دراسة تجديد تجدد باستخدام كل الكائنات التجدد "الكلاسيكية"، مثل الهيدرا، المستورقات وUrodeles، فضلا عن طائفة واتساع الأنواع التي تغطي مجموعة من metazoa، من الإسفنج من خلال الثدييات. وإلى جانب الفائدة الجوهرية بوصفها ظاهرة بيولوجية، وفهم كيفية عمل تجديد في مجموعة متنوعة من الأنواع سوف تبلغنا حول ما إذا كانت عمليات التجدد تشترك الميزات و / أو الأنواع الشائعة أو الآليات الخلوية والجزيئية للسياق معين. وشقائق البحر نجيمة، Nematostella vectensis، هو كائن نموذجا الناشئة على التجدد. مثل هيدرا، Nematostella هو عضو في الأسرة في اللغات القديمة، القراصات، ولكن في غضون رانه الطبقة الحيزهير، كليد شقيقة لالهدروانيات هذا هو أكثر تطويريا القاعدية. والجوانب وبالتالي من تجديد في Nematostella تكون مثيرة للاهتمام لمقارنة ومع تلك هيدرا والكائنات المجوفة الأخرى. في هذه المقالة، فإننا نقدم وسيلة لشطر، ومراقبة وتصنيف تجديد نهاية مجافي الفم من الكبار Nematostella، وهو ما يسمى المنفخة. والمنفخة يخضع بطبيعة الحال الانشطار كوسيلة من التكاثر اللاجنسي، وإما الانشطار الطبيعي أو بتر اليدوي للالمنفخة يؤدي إعادة النمو والإصلاح من الأشكال التضاريسية المعقدة. هنا قمنا دونت هذه التغييرات الشكلية البسيطة في نظام Nematostella التجديد التدريج (وNRSS). نحن نستخدم NRSS لاختبار آثار الكلوروكين، المانع من وظيفة الليزوزومية الذي يمنع الالتهام الذاتي. وأظهرت النتائج أن تجديد هياكل ورم، لا سيما المساريقا، غير طبيعي عندما يتم تثبيط الالتهام الذاتي.
Introduction
كانت الملاحظة التجديد في هيدرا واحد من الحدث البارز في ظهور البيولوجيا باعتبارها 1،2 العلم التجريبي. يبقى تجديد ظاهرة نداء واسع للغاية إلى الأحياء ووضع الشخص على حد سواء. إمكانية علماء البيولوجيا التطورية والأطباء وعلماء الطب الحيوي والمهندسين الأنسجة لفهم والتغلب على القيود المفروضة على تجديد البشري يجعل البيولوجيا تجديد أكثر من مثيرة للاهتمام في جوهرها.
الآن، مع استخدام التكنولوجيات الناشئة مثل تسلسل الجينوم والربح والخسارة من أدوات وظيفة، تستعد الميدان لندف آليات التجدد، وبصرف النظر لفهم في النهاية كيف الأنواع المختلفة يمكن أن تتجدد في حين لا يمكن للآخرين. وتبقى درجة من القواسم المشتركة في الردود الجزيئية الخلوية والمورفولوجية إلى توضيح، ولكن حتى الآن يبدو أن ردود الأساسية بين الحيوانات التي يمكن أن تتجدد هو أكثر مماثلة مما كان imagiنيد فقط قبل عقد من الزمن 3.
الكائنات المجوفة على وجه الخصوص هي السطحية في تجديد ما يقرب من جميع أجزاء جسمها وسط مجموعة واسعة من التنوع الصرفي. من الانفرادي ورم المياه العذبة، هيدرا جنبا إلى جنب مع الاورام الحميدة البحرية الصغيرة التي تبني الشعاب المرجانية الهائلة، إلى siphonophores الاستعماري معقدة، مثل البرتغالية رجل-O-الحرب، وتجديد وغالبا ما يكون وضع الإنجاب، بالإضافة إلى آلية ل إصلاح أو إصلاح أجزاء الجسم التالفة أو المفقودة الناتجة من الاصابة والافتراس. إذا كانت الأنواع المختلفة من القراصات استخدام آليات مماثلة أو مختلفة لتجديد هو مسألة مثيرة للاهتمام بشكل أساسي 4-6.
ونحن، والبعض الآخر تم تطوير وanthozoan، Nematostella vectensis كنموذج للتجديد 7-17. نحن وضعت مؤخرا نظام التدريج لوصف تجديد لكامل الجسم من قطعة موحدة شكليا من الأنسجة شطر من أبورال نهاية ورم 10. بينما الاورام الحميدة Nematostella يمكن تجديد عندما شطر على أي مستوى، اخترنا لخفض البالغين في موقف مجافي الفم في المنطقة الأكثر بسيطة شكليا، والمنفخة، في جزء منه لأن هذا هو على مقربة من الطائرة العادية للانشطار اللاجنسي الطبيعي 18، وأيضا لأنه مراقبة التصاريح والتحليلات الجزيئية لكيفية تجميعها على كامل الجسم من أبسط المكونات الشكلية.
والتدريج النظام Nematostella التجديد (NRSS) يوفر مجموعة بسيطة نسبيا من المعايير الشكلية التي يمكن استخدامها ليسجل تقدم في أي جانب من جوانب التجديد من قبل المنفخة بتر، في ظل ظروف ثقافة العادية أو أقلقت تجريبيا الحالات مثل علاج جزيء صغير، والتلاعب الجيني ، أو تغيير البيئة. كما كان متوقعا، وأصبح اعتمدت NRSS كما سقالة المورفولوجية التي الأحداث الخلوية والجزيئية للتجديد يمكن الرجوع إليها10.
أخيرا أسلوبنا في قطع تنتج فجوة عدة أوامر من حجم أكبر من ثقب نقطة دبوس المستخدمة في دراسة حديثة 17، إلا أن كلا من الجروح تلتئم في حوالي 6 ساعات. يجب توثيق مراحل اعتقال بصريا ومتميزة من إغلاق الجرح اقتراح نهج التجريبية لشرح استقلال واضح من حجم الجرح والوقت الذي يستغرقه لإغلاقه. وبالتالي، فهم البصرية أعمق لعملية بتر مجافي الفم، المنصوص عليها في هذا البروتوكول، سيساعد مزيد من التحقيقات في هذا النظام تجديد نموذج وتوسيع تطبيق هذا النظام انطلاق باستخدام Nematostella vectensis.
Protocol
Representative Results
Discussion
استخدام Nematostella كنموذج للالتئام الجروح وتجديد تزداد شعبية. وبالتالي، فمن المهم أن تكون قادرا على تصور أنماط شكلية بروتوكول معين قبل التحاليل الخلوية والجزيئية فعالة يمكن تعيين ومقارنة. Nematostella يكون على درجة عالية من "المرونة" التجدد، أن تكون قادرة على ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل الخلايا الجذعية نيويورك العلوم (NYSTEM C028107) منحة لGHT.
Materials
| Nematostella vectensis, adults | Marine Biological Lab (MBL) | non-profit supplier | |
| Glass Culture Dish, 250 ml | Carolina Biological Supply | 741004 | 250 ml |
| Glass Culture Dish, 1,500 ml | Carolina Biological Supply | 741006 | 1,500 ml |
| Polyethylene transfer pipette, 5ml | USA Scientific | 1022-2500 | narrow bore, graduated |
| Polyethylene transfer pipet, tapered | Samco | 202-205 | cut off 1 inch of tip to make wide bore |
| Disposable Scalpel | Feather Safety Razor Co. Ltd | no. 10 | blade should be curved |
| #5 Dumont Fine point tweezers | Roboz | RS5045 | alternative suppliers available |
| Pyrex petri dish, 100 mm diameter | Corning | 3160 | can substitute other glass petri plates |
| Sterile 6 well plate | Corning Falcon | 353046 | or similar from other manufacturer |
| Sterile 12 well plate | Nunc | 150628 | or similar from other manufacturer |
| Sterile 24 well plate | Cellstar, Greiner bio-one | 662-160 | or similar from other manufacturer |
| Brine shrimp hathery kit | San Francisco Bay; drsfostersmith.com | CD-154005 | option for growing brine shrimp |
| pyrex baking dish | common in grocery stores | option for growing brine shrimp | |
| artificial seawater mix 50 gal or more | Instant Ocean; drsfoster-smith.com | CD-116528 | others brands may suffice |
| Plastic tub for stock ASW preparation | various | common 25 gallon plastic trash can OK | |
| Polypropylene Carboy | Carolina Biological Supply | 716391 | For working stock of ASW @ 12 ppt |
| Beaker, Graduated, 4,000ml | PhytoTechnology Laboratories | B199 | For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt |
| Stereomicroscope and light source | various | with continuous 1 – 40x magnification |
References
- Lenhoff, S. G., Lenhoff, H. M. . Hydra and the Birth of Experimental Biology: Abraham Trembley’s Memoirs Concerning the Natural History of a Type of Freshwater Polyp with Arms Shaped like Horns. , (1986).
- Trembley, A. . Mémoires pour servir à l’histoire d’un genre de polypes d’eau douce, à bras en forme de cornes. , (1744).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).
- Galliot, B. Hydra, a fruitful model system for 270 years. Int J Dev Biol. 56 (6-8), 411-423 (2012).
- Gold, D. A., Jacobs, D. K. Stem cell dynamics in Cnidaria: are there unifying principles?. Dev Genes Evol. 233 (1-2), 53-66 (2013).
- Holstein, T. W., Hobmayer, E., Technau, U. Cnidarians: an evolutionarily conserved model system for regeneration?. Dev Dyn. 226 (2), 257-267 (2003).
- Amiel, A. R., et al. Characterization of Morphological and Cellular Events Underlying Oral Regeneration in the Sea Anemone, Nematostella vectensis. Int J Mol Sci. 16 (12), 28449-28471 (2015).
- Warren, C. R., et al. Evolution of the perlecan/HSPG2 gene and its activation in regenerating Nematostella vectensis. PLoS One. 10 (4), e0124578 (2015).
- Gong, Q., et al. Integrins of the starlet sea anemone Nematostella vectensis. Biol Bull. 227 (3), 211-220 (2014).
- Bossert, P. E., Dunn, M. P., Thomsen, G. H. A staging system for the regeneration of a polyp from the aboral physa of the anthozoan Cnidarian Nematostella vectensis. Dev Dyn. 242 (11), 1320-1331 (2013).
- Stefanik, D. J., Friedman, L. E., Finnerty, J. R. Collecting, rearing, spawning and inducing regeneration of the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nat Protoc. 8 (5), 916-923 (2013).
- Tucker, R. P., et al. A thrombospondin in the anthozoan Nematostella vectensis is associated with the nervous system and upregulated during regeneration. Biol Open. 2 (2), 217-226 (2013).
- Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis. BMC Dev Biol. 12, (2012).
- Trevino, M., Stefanik, D. J., Rodriguez, R., Harmon, S., Burton, P. M. Induction of canonical Wnt signaling by alsterpaullone is sufficient for oral tissue fate during regeneration and embryogenesis in Nematostella vectensis. Dev Dyn. 240 (12), 2673-2679 (2011).
- Renfer, E., Amon-Hassenzahl, A., Steinmetz, P. R., Technau, U. A muscle-specific transgenic reporter line of the sea anemone, Nematostella vectensis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (1), 104-108 (2010).
- Burton, P. M., Finnerty, J. R. Conserved and novel gene expression between regeneration and asexual fission in Nematostella vectensis. Dev Genes Evol. 219 (2), 79-87 (2009).
- DuBuc, T. Q., Traylor-Knowles, N., Martindale, M. Q. Initiating a regenerative response; cellular and molecular features of wound healing in the cnidarian Nematostella vectensis. BMC Biol. 12, (2014).
- Hand, C., Uhlinger, K. R. Asexual reproduction by transverse fission and some anomalies in the sea anemone Nematostella vectensis. Invert Biol. 114, 9-18 (1995).
- Fritzenwanker, J. H., Technau, U. Induction of gametogenesis in the basal cnidarian Nematostella vectensis(Anthozoa). Dev Genes Evol. 212 (2), 99-103 (2002).
- Magie, C., Bossert, P., Aramli, L., Thomsen, G. Science’s super star: The starlet sea anemone is an ideal tool for student inquiry. The Science Teacher. 83 (3), 33-40 (2016).
- Genikhovich, G., Technau, U. In situ hybridization of starlet sea anemone (Nematostella vectensis) embryos, larvae, and polyps. Cold Spring Harb Protoc. (9), (2009).
- Magie, C. R., Pang, K., Martindale, M. Q. Genomic inventory and expression of Sox and Fox genes in the cnidarian Nematostella vectensis. Dev Genes Evol. 215 (12), 618-630 (2005).
- Chera, S., Kaloulis, K., Galliot, B. The cAMP response element binding protein (CREB) as an integrative HUB selector in metazoans: clues from the hydra model system. Biosystems. 87 (2-3), 191-203 (2007).
- Reitzel, A. M., Burton, P. M., Krone, C., Finnerty, J. R. Comparison of developmental trajectories in the starlet sea anemone Nematostella vectensis: embryogenesis, regeneration, and two forms of asexual fission. Invertebr Biol. 126, 99-112 (2007).
- Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis. Nat Commun. 5, 5486 (2014).
- Jahnel, S. M., Walzl, M., Technau, U. Development and epithelial organisation of muscle cells in the sea anemone Nematostella vectensis. Front Zool. 11, 44 (2014).
- Kelava, I., Rentzsch, F., Technau, U. Evolution of eumetazoan nervous systems: insights from cnidarians. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 370 (1684), (2015).
- Nakanishi, N., Renfer, E., Technau, U., Rentzsch, F. Nervous systems of the sea anemone Nematostella vectensis are generated by ectoderm and endoderm and shaped by distinct mechanisms. Development. 139 (2), 347-357 (2012).
- Richards, G. S., Rentzsch, F. Transgenic analysis of a SoxB gene reveals neural progenitor cells in the cnidarian Nematostella vectensis. Development. 141 (24), 4681-4689 (2014).
- DuBuc, T. Q., et al. In vivo imaging of Nematostella vectensis embryogenesis and late development using fluorescent probes. BMC Cell Biol. 15, (2014).
- Kaur, J., Debnath, J. Autophagy at the crossroads of catabolism and anabolism. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (8), 461-472 (2015).
- Carroll, B., Korolchuk, V. I., Sarkar, S. Amino acids and autophagy: cross-talk and co-operation to control cellular homeostasis. Amino Acids. 47 (10), 2065-2088 (2015).
- Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. Autophagy: cellular and molecular mechanisms. J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).
- Rodolfo, C., Di Bartolomeo, S., Cecconi, F. Autophagy in stem and progenitor cells. Cell Mol Life Sci. 73 (3), 475-496 (2016).
- Guan, J. L., et al. Autophagy in stem cells. Autophagy. 9 (6), 830-849 (2013).
- Phadwal, K., Watson, A. S., Simon, A. K. Tightrope act: autophagy in stem cell renewal, differentiation, proliferation, and aging. Cell Mol Life Sci. 70 (1), 89-103 (2013).
- Varga, M., Fodor, E., Vellai, T. Autophagy in zebrafish. Methods. 75, 172-180 (2015).
- Varga, M., et al. Autophagy is required for zebrafish caudal fin regeneration. Cell Death Differ. 21 (4), 547-556 (2014).
- Gonzalez-Estevez, C., Salo, E. Autophagy and apoptosis in planarians. Apoptosis. 15 (3), 279-292 (2010).
- Buzgariu, W., Chera, S., Galliot, B. Methods to investigate autophagy during starvation and regeneration in hydra. Methods Enzymol. 451, 409-437 (2008).
- Tettamanti, G., et al. Autophagy in invertebrates: insights into development, regeneration and body remodeling. Curr Pharm Des. 14 (2), 116-125 (2008).
