स्टारलेट समुद्री एनीमोन की एबोरल Physa से पूरा नाकड़ा पुनर्जनन उत्प्रेरण<em> Nematostella vectensis</em

Summary

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Abstract

निडारियंस, और विशेष रूप से हाइड्रा, क्षतिग्रस्त या कटे संरचनाओं, और वास्तव में यकीनन Trembley के काम के माध्यम से आधुनिक जैविक जांच की तुलना में अधिक 250 साल पहले शुरू इस तरह के अध्ययन को पुनर्जीवित करने के लिए दिखाया पहली जानवरों के थे। वर्तमान में उत्थान के अध्ययन स्पंज से स्तनधारियों के माध्यम से एक पुनरुत्थान ऐसे हाइड्रा, planaria और Urodeles के रूप में दोनों "क्लासिक" पुनर्योजी जीवों का उपयोग कर, साथ ही Metazoa की सीमा में फैले प्रजातियों में से एक को चौड़ा स्पेक्ट्रम, देखा गया है। एक जैविक घटना के रूप में अपनी आंतरिक ब्याज इसके अलावा, समझ कैसे उत्थान प्रजाति की एक किस्म में काम करता है के बारे में हमें पुनर्योजी प्रक्रियाओं आम सुविधाओं और / या प्रजाति या संदर्भ विशेष सेलुलर और आणविक तंत्र का हिस्सा है कि क्या सूचित करेंगे। स्टारलेट समुद्री एनीमोन, Nematostella vectensis, उत्थान के लिए एक उभरती हुई मॉडल जीव है। हाइड्रा की तरह, Nematostella प्राचीन जाति, cnidaria का एक सदस्य है, लेकिन टी के भीतरवह वर्ग anthozoa, हाइड्रोज़ोआ evolutionarily अधिक बेसल है कि करने के लिए एक बहन क्लेड। इस प्रकार Nematostella में उत्थान के पहलुओं की तुलना और हाइड्रा और अन्य निडारियंस के उन लोगों के साथ इसके विपरीत करने के लिए दिलचस्प हो जाएगा। इस अनुच्छेद में, हम, दोटूक पालन और Nematostella वयस्क, जो physa कहा जाता है की एबोरल अंत के उत्थान वर्गीकृत करने के लिए एक तरीका मौजूद है। physa स्वाभाविक रूप से अलैंगिक प्रजनन के एक साधन के रूप में विखंडन की प्रक्रिया से गुजरते हैं, और या तो प्राकृतिक विखंडन या physa के मैनुअल विच्छेदन चलाता है फिर से विकास और जटिल morphologies के सुधार। यहाँ हम एक Nematostella पुनर्जनन मचान प्रणाली (NRSS) में इन सरल morphological परिवर्तन संहिताबद्ध है। हम NRSS का उपयोग क्लोरोक्वीन के प्रभाव, लाइसोसोमल समारोह है कि ब्लॉक भोजी के एक अवरोध का परीक्षण करने के लिए। परिणाम बताते हैं कि नाकड़ा संरचनाओं, विशेष रूप से mesenteries, के उत्थान असामान्य है जब भोजी हिचकते हैं।

Introduction

एक भी हाइड्रा में उत्थान के अवलोकन के एक प्रायोगिक विज्ञान ^1,2 के रूप में जीव विज्ञान के आगमन में लाभदायक घटना थी। पुनर्जनन जीवविज्ञानी को असाधारण व्यापक अपील की एक घटना बनी हुई है और व्यक्ति को समान रूप से निहित है। विकासात्मक जीव, चिकित्सकों, जैव चिकित्सा वैज्ञानिकों और इंजीनियरों के ऊतकों को समझते हैं और मानव उत्थान पर सीमा पर काबू पाने के लिए संभावित उत्थान जीव विज्ञान आंतरिक रूप से दिलचस्प और अधिक से अधिक बनाता है।

अब, इस तरह के जीनोम अनुक्रमण और लाभ और समारोह उपकरणों की हानि के रूप में उभरती प्रौद्योगिकियों के उपयोग के साथ, क्षेत्र के अलावा पुनर्योजी तंत्र तंग करने के लिए तैयार है और अंत में समझने के लिए कैसे विभिन्न प्रजातियों पुनर्जीवित कर सकते हैं, जबकि दूसरों को नहीं कर सकते। आणविक, सेलुलर और रूपात्मक प्रतिक्रियाओं में समानता की डिग्री elucidated जाना बना रहता है, लेकिन अभी तक ऐसा लगता है कि जानवरों के बीच बुनियादी प्रतिक्रियाएं कि पुनर्जीवित कर सकते हैं और अधिक समान से Imagi हो गया होता हैनेड केवल एक दशक पहले ^3।

विशेष रूप से निडारियंस रूपात्मक विविधता का एक व्यापक स्पेक्ट्रम के बीच अपने शरीर के अंगों के लगभग सभी regenerating पर सतही हैं। एकान्त ताजा पानी नाकड़ा से, हाइड्रा छोटे समुद्री जंतु कि अपार प्रवाल भित्तियों का निर्माण, ऐसे पुर्तगाली मैन-ओ-युद्ध के रूप में जटिल औपनिवेशिक siphonophores, करने के साथ-साथ, उत्थान अक्सर प्रजनन की एक विधा है, इसके अलावा में के लिए एक तंत्र है मरम्मत या क्षतिग्रस्त या खो शरीर की चोट और शिकार से उत्पन्न भागों में सुधार। चाहे नीडेरिया की विभिन्न प्रजातियों के उत्थान के लिए समान या अलग तंत्र का उपयोग एक मौलिक दिलचस्प सवाल ^4-6 है।

हम, और दूसरों anthozoan विकसित किया गया है, Nematostella उत्थान ^7-17 के लिए एक मॉडल के रूप में vectensis। हमने हाल ही में ऊतक के एक आकृति विज्ञान एक समान टुकड़ा abora से bisected से एक पूरे शरीर के उत्थान वर्णन करने के लिए एक मचान प्रणाली विकसित कीनाकड़ा ¹⁰ के एल अंत। यह भी है क्योंकि जब किसी भी स्तर पर bisected Nematostella जंतु पुनर्जीवित कर सकते हैं, वहीं हम सबसे आकृति विज्ञान सरल क्षेत्र, physa में एक एबोरल स्थिति में वयस्कों में कटौती करने, भाग में, क्योंकि इस प्राकृतिक अलैंगिक विखंडन ¹⁸ के सामान्य विमान के करीब है चुना है, और परमिट अवलोकन और कैसे एक पूरे शरीर सरलतम रूपात्मक घटकों से reassembled है आणविक विश्लेषण।

Nematostella पुनर्जनन मचान प्रणाली (NRSS) सामान्य संस्कृति की शर्तों के तहत, रूपात्मक मानक है कि एक काट physa द्वारा उत्थान के किसी भी पहलू की प्रगति स्कोर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की एक अपेक्षाकृत सरल सेट प्रदान करता है या प्रयोगात्मक इस तरह के छोटे अणु उपचार, आनुवंशिक हेरफेर के रूप में स्थितियों परेशान , या पर्यावरण परिवर्तन। के रूप में प्रत्याशित, NRSS एक रूपात्मक पाड़ जिस पर उत्थान के सेलुलर और आणविक घटनाओं संदर्भित किया जा सकता के रूप में अपनाया जा रहा है10।

अंत में काटने की हमारी विधि पिन बिंदु एक ताजा अध्ययन में ¹⁷ में इस्तेमाल किया पंचर से अधिक परिमाण के एक दूरी छेद कई आदेशों का उत्पादन, अभी तक दोनों घाव 6 घंटे के आसपास में चंगा। घाव बंद की नेत्रहीन को गिरफ्तार करने और अलग चरणों दस्तावेजीकरण प्रयोगात्मक दृष्टिकोण सुझाव है कि एक घाव के आकार और समय इसे बंद करने के लिए लेता है की स्पष्ट व्याख्या करने के लिए स्वतंत्रता चाहिए। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल द्वारा प्रदान की एबोरल विच्छेदन प्रक्रिया की एक गहरी समझ दृश्य, इस मॉडल के उत्थान प्रणाली में आगे की जांच के लिए सहायता और इस मचान Nematostella vectensis का उपयोग कर प्रणाली के आवेदन व्यापक होगा।

Protocol

तापमान, पोषण और / प्रकाश अंधेरे चक्र के लिए पशुओं की 1. कंडीशनिंग कई Nematostella प्रयोगशालाओं में से एक दुनिया भर में, या एक गैर लाभ आपूर्तिकर्ता से प्राप्त Nematostella vectensis वयस्कों (तालिका 1) अंधेरे …

Representative Results

कटे physa में उत्थान के दौरान रूपात्मक की घटनाओं की प्रगति चित्रा 1 ए है, जो प्रत्येक NRSS चरण में physa के प्रतिनिधि दृश्य भी शामिल है में दिखाया गया है। ठेठ physa कटौती साइट वयस्क (तीर) पर संकेत दि?…

Discussion

घाव भरने और उत्थान की एक मॉडल के रूप में Nematostella का उपयोग तेजी से लोकप्रिय होता जा रहा है। इस प्रकार, यह सौंपा और तुलना की जा सकती महत्वपूर्ण है प्रभावी सेलुलर और आणविक विश्लेषण करने से पहले एक विशेष प्र…

Materials

Nematostella vectensis, adults	Marine Biological Lab (MBL)		non-profit supplier
Glass Culture Dish, 250 ml	Carolina Biological Supply	741004	250 ml
Glass Culture Dish, 1,500 ml	Carolina Biological Supply	741006	1,500 ml
Polyethylene transfer pipette, 5ml	USA Scientific	1022-2500	narrow bore, graduated
Polyethylene transfer pipet, tapered	Samco	202-205	cut off 1 inch of tip to make wide bore
Disposable Scalpel	Feather Safety Razor Co. Ltd	no. 10	blade should be curved
#5 Dumont Fine point tweezers	Roboz	RS5045	alternative suppliers available
Pyrex petri dish, 100 mm diameter	Corning	3160	can substitute other glass petri plates
Sterile 6 well plate	Corning Falcon	353046	or similar from other manufacturer
Sterile 12 well plate	Nunc	150628	or similar from other manufacturer
Sterile 24 well plate	Cellstar, Greiner bio-one	662-160	or similar from other manufacturer
Brine shrimp hathery kit	San Francisco Bay; drsfostersmith.com	CD-154005	option for growing brine shrimp
pyrex baking dish	common in grocery stores		option for growing brine shrimp
artificial seawater mix 50 gal or more	Instant Ocean; drsfoster-smith.com	CD-116528	others brands may suffice
Plastic tub for stock ASW preparation	various		common 25 gallon plastic trash can OK
Polypropylene Carboy	Carolina Biological Supply	716391	For working stock of ASW @ 12 ppt
Beaker, Graduated, 4,000ml	PhytoTechnology Laboratories	B199	For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt
Stereomicroscope and light source	various		with continuous 1 – 40x magnification