Induserende Komplett Polyp Regeneration fra Aboral Physa av Starlet Sea Anemone<em> Nematostella vectensis</em

Summary

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Abstract

Nesledyrene, og spesielt Hydra, var de første dyrene vist seg å regenerere skadede eller avkuttede strukturer, og faktisk slike studier uten tvil lansert moderne biologisk henvendelse gjennom arbeidet Trembley mer enn 250 år siden. For tiden er studiet av regenerering har sett en fornyet bruk av både "klassiske" regenerative organismer, slik som Hydra, planaria og Urodeles, samt en utvidelse spektrum av arter som spenner over området metazoer, fra svamper gjennom pattedyr. Foruten sin iboende interesse som et biologisk fenomen, vil forstå hvordan regenerering fungerer på en rekke arter informere oss om hvorvidt regenerative prosesser dele fellestrekk og / eller arter eller kontekstspesifikke cellulære og molekylære mekanismer. Den starlet sjøanemone, Nematostella vectensis, er en ny modellorganisme for regenerering. Som Hydra, er Nematostella et medlem av den gamle phylum, Cnidaria, men innenfor tHan klasse Anthozoa, en søster clade til småmaneter som er evolusjonært mer basal. Dermed aspekter av regenerering i Nematostella vil være interessant å sammenligne og kontrast med de av Hydra og andre nesledyr. I denne artikkelen presenterer vi en metode for å halvere, observere og klassifisere regenerering av aboral slutten av Nematostella voksen, som kalles physa. Den physa gjennomgår naturlig fisjon som et middel for aseksuell reproduksjon, og enten naturlig fisjon eller manuell amputasjon av physa utløser ny vekst og reformasjon av komplekse morfologi. Her har vi kodifisert disse enkle morfologiske endringer i en Nematostella Regeneration Staging System (den NRSS). Vi bruker NRSS for å teste effekten av klorokin, en inhibitor av lysosomal funksjon som blokkerer autophagy. Resultatene viser at regenereringen av polyp strukturer, spesielt mesenteries, er unormal når autofagi er sperret.

Introduction

Observasjonen av regenerering i en enkelt hydra var banebrytende hendelse i advent av biologi som en eksperimentell vitenskap ^1,2. Regeneration er fortsatt et fenomen av usedvanlig bred appell til biolog og lå person likt. Potensialet for utviklings biologer, leger, biomedisinske forskere og ingeniører vev til å forstå og overvinne grensene for menneskelig regenerering gjør regenerering biologi mer enn egentlig interessant.

Nå, med bruk av nye teknologier som genomsekvensering og gevinst og tap av funksjon verktøy, er feltet klar til å erte hverandre regenerative mekanismer og til slutt forstå hvordan ulike arter kan regenerere mens andre ikke kan. Graden av felles i molekylære, cellulære og morfologiske responser er ikke avklart, men så langt ser det ut som de grunnleggende reaksjoner blant dyr som kan regenerere er mer lik enn det som ville ha vært Imagined bare et tiår siden ^3.

Nesledyrene er spesielt lettvinte ved gjenoppfriske nesten alle sine kroppsdeler midt i et bredt spekter av morfologisk mangfold. Fra den ensomme ferskvann polypp, Hydra sammen med de små marine polypper som bygger enorme korallrev, til de komplekse koloni siphonophora, slik som den portugisiske Man-O-War, er regenerering ofte en modus for reproduksjon, i tillegg til en mekanisme for reparere eller reformere skadet eller mistet kroppsdeler som følge av skade og predasjon. Hvorvidt de ulike arter av Cnidaria bruke lignende eller ulike mekanismer for regenerering er et fundamentalt interessant spørsmål ^4-6.

Vi, og andre har vært å utvikle anthozoan, Nematostella vectensis som en modell for regenerering ^7-17. Vi har nylig utviklet en iscenesettelse system for å beskrive regenerering av en hele kroppen fra et morfologisk uniform stykke vev halvert fra Aboral enden av polypp ^10. Mens Nematostella polypper kan regenerere da delt i to ved en hvilken som helst nivå, valgte vi å skjære voksne i en aboral posisjon i den mest morfologisk enkel region, den physa, dels fordi dette er nær det normale planet for naturlig aseksuell fisjons ^18, og også fordi det tillatelser observasjon og molekylære analyser av hvordan en hele kroppen er satt sammen fra de enkleste morfologiske komponenter.

Nematostella Regeneration Staging System (NRSS) gir et relativt enkelt sett med morfologiske benchmarks som kan brukes til å sette fremdriften av noen aspekter av regenerering av en amputert physa, under normale kultur forhold eller eksperimentelt opprørt situasjoner som små molekyl behandlinger, genetisk manipulering eller miljømessige endringer. Som forventet, er NRSS blir vedtatt som en morfologisk stillaset som de cellulære og molekylære hendelser av regenerering kan refereres10.

Endelig vår metode for skjæring produserer et gapende hull flere størrelsesordener større enn fint punktering brukt i en fersk undersøkelse ^17, men begge sår leges i rundt 6 timer. Dokumentere visuelt fremtredende og distinkte faser av sårlukking skal foreslå eksperimentelle tilnærminger for å forklare den tilsynelatende uavhengig av størrelsen av et sår, og den tid det tar å lukke. Dermed vil en dypere visuell forståelse av aboral amputasjon prosessen, levert av denne protokollen, vil hjelpe videre undersøkelser i denne modellen regenerering system og utvide anvendelsen av denne iscenesettelsen systemet med Nematostella vectensis.

Protocol

1. Conditioning of Animals for temperatur, ernæring og lys / mørke-syklus Skaff Nematostella vectensis voksne fra en av de mange Nematostella laboratorier over hele verden, eller en non-profit leverandør (tabell 1) Oppretthold Nematostella ved konstant temperatur (typisk mellom 18 og 21 ° C) i mørket, i "1 / 3x" kunstig sjøvann (ASW) ved et saltinnhold på 12 deler pr tusen (ppt). Oppretthold kulturer i enkle soda-lime glass kultur retter, …

Representative Results

Progresjonen av morfologiske hendelser under regenerering i avkuttede physa er vist i figur 1A, som inkluderer representative visninger av physa på hvert NRSS trinn. Den typiske physa kutt nettstedet er angitt på den voksne (pilspisser). Fotografiene i figur 1A viser progressive regenerering av muntlige og kroppsstrukturer fra nyklipt physa gjennom fullt dannet polypp. Figur 1B, C viser arrangementet av interne septa, de mesenteries, p…

Discussion

Bruk av Nematostella som en modell for sårheling og regenerering blir stadig mer populært. Derfor er det viktig å være i stand til å visualisere de morfologiske mønstre av en bestemt protokoll før effektive cellulære og molekylære analyser kan tildeles og sammenlignes. Nematostella har en høy grad av regenerativ "fleksibilitet", være i stand til å reformere nesten alle mangler struktur amputert på ethvert sted, på post-Planula stadier av livet. Dermed har ulike forskere undersø…

Materials

Nematostella vectensis, adults	Marine Biological Lab (MBL)		non-profit supplier
Glass Culture Dish, 250 ml	Carolina Biological Supply	741004	250 ml
Glass Culture Dish, 1,500 ml	Carolina Biological Supply	741006	1,500 ml
Polyethylene transfer pipette, 5ml	USA Scientific	1022-2500	narrow bore, graduated
Polyethylene transfer pipet, tapered	Samco	202-205	cut off 1 inch of tip to make wide bore
Disposable Scalpel	Feather Safety Razor Co. Ltd	no. 10	blade should be curved
#5 Dumont Fine point tweezers	Roboz	RS5045	alternative suppliers available
Pyrex petri dish, 100 mm diameter	Corning	3160	can substitute other glass petri plates
Sterile 6 well plate	Corning Falcon	353046	or similar from other manufacturer
Sterile 12 well plate	Nunc	150628	or similar from other manufacturer
Sterile 24 well plate	Cellstar, Greiner bio-one	662-160	or similar from other manufacturer
Brine shrimp hathery kit	San Francisco Bay; drsfostersmith.com	CD-154005	option for growing brine shrimp
pyrex baking dish	common in grocery stores		option for growing brine shrimp
artificial seawater mix 50 gal or more	Instant Ocean; drsfoster-smith.com	CD-116528	others brands may suffice
Plastic tub for stock ASW preparation	various		common 25 gallon plastic trash can OK
Polypropylene Carboy	Carolina Biological Supply	716391	For working stock of ASW @ 12 ppt
Beaker, Graduated, 4,000ml	PhytoTechnology Laboratories	B199	For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt
Stereomicroscope and light source	various		with continuous 1 – 40x magnification