Inducir completa Pólipo regeneración de la aboral Physa de la anémona de mar Starlet<em> Vectensis Nematostella</em

Summary

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Abstract

Cnidarios, y en concreto Hydra, fueron los primeros animales indicado para regenerar estructuras dañadas o cortadas, y de hecho podría decirse que este tipo de estudios en marcha la investigación biológica moderna a través de la obra de Trembley hace más de 250 años. En la actualidad el estudio de la regeneración ha visto un resurgimiento usando ambos organismos regenerativas "clásicos", como la hidra, planaria y Urodeles, así como un espectro ensanchamiento de las especies que abarcan la gama de metazoos, a través de las esponjas mamíferos. Además de su interés intrínseco como un fenómeno biológico, la comprensión de cómo funciona la regeneración en una variedad de especies nos informará acerca de si los procesos regenerativos comparten características y / o especies comunes o mecanismos celulares y moleculares específicas del contexto. La anémona de mar estrella, Nematostella vectensis, es un organismo modelo emergente para la regeneración. Al igual que Hydra, Nematostella es un miembro de la antigua phylum, cnidarios, pero dentro de tque anthozoa clase, un clado hermano a la hidrozoos que es evolutivamente más basal. Así, los aspectos de la regeneración en Nematostella será interesante comparar y contrastar con los de Hydra y otros cnidarios. En este artículo, presentamos un método para dividir en dos, observar y clasificar a la regeneración del extremo aboral del adulto Nematostella, que se llama el Physa. El Physa sufre naturalmente fisión como medio de reproducción asexual, y, o bien la fisión natural o amputación manual de la Physa desencadena re-crecimiento y la reforma de morfologías complejas. Aquí hemos codificado estos cambios morfológicos simples en un Sistema de estadificación Nematostella Regeneración (la NRSS). Usamos la NRSS para poner a prueba los efectos de la cloroquina, un inhibidor de la función lisosomal que bloquea la autofagia. Los resultados muestran que la regeneración de estructuras de pólipos, en particular los mesenterios, es anormal cuando se inhibe la autofagia.

Introduction

La observación de la regeneración en un solo hydra fue el evento seminal en el advenimiento de la biología como un ^1,2 ciencia experimental. La regeneración sigue siendo un fenómeno extraordinariamente amplia de apelación al biólogo y laico por igual. La posibilidad de que los biólogos del desarrollo, médicos, científicos e ingenieros biomédicos de tejido para comprender y superar los límites de la regeneración humana hace que la biología de regeneración más intrínsecamente interesante.

Ahora, con el uso de las tecnologías emergentes, tales como la secuenciación del genoma y la ganancia y pérdida de función de las herramientas, el campo está a punto de burlarse de los mecanismos regenerativos aparte y para entender en última instancia cómo varias especies pueden regenerarse mientras que otros no pueden. El grado de coincidencia en las respuestas moleculares, celulares y morfológicos que queda por esclarecer, pero hasta el momento parece que las respuestas básicas entre los animales que pueden regenerar es más similar que habría sido ImagiNed hace sólo una década ^3.

Cnidarios en particular, son fácil a la regeneración casi todas las partes del cuerpo en medio de un amplio espectro de diversidad morfológica. Desde el pólipo solitario agua dulce, Hydra junto con los pequeños pólipos marinos que construyen inmensos arrecifes de coral, a los sifonóforos coloniales complejos, tales como el portugués Man-O-War, la regeneración es a menudo un modo de reproducción, además de un mecanismo para la reparación o la reforma de las partes del cuerpo dañados o perdidos como resultado de la lesión y la depredación. Si las diversas especies de cnidarios utilizan mecanismos similares o diferentes para la regeneración es una pregunta interesante, fundamentalmente, ^4-6.

Nosotros, y otros han estado desarrollando la anthozoan, Nematostella vectensis como modelo para la regeneración ^7-17. Recientemente hemos desarrollado un sistema de clasificación para describir la regeneración de un cuerpo entero de un pedazo de tejido morfológicamente uniforme dividido en dos de los ABORAl final del pólipo ^10. Mientras que los pólipos Nematostella pueden regenerarse cuando queda dividido en dos en cualquier nivel, se optó por cortar los adultos en una posición aboral en la región más morfológicamente simple, el Physa, en parte porque este está cerca del plano normal de la fisión asexual natural de ^{18 años,} y también porque permite la observación y análisis moleculares de cómo un cuerpo entero se vuelve a montar a partir de los componentes morfológicos simples.

El sistema de estadificación Nematostella Regeneración (NRSS) proporciona un conjunto relativamente simple de los puntos de referencia morfológicas que podrían ser utilizados para marcar el progreso de cualquier aspecto de la regeneración por un Physa amputada, en condiciones de cultivo normales o experimentalmente perturbado situaciones tales como tratamientos de molécula pequeña, la manipulación genética o alteración ambiental. Como se preveía, el NRSS se está adoptado como un andamio morfológica en la que puede hacer referencia a los eventos celulares y moleculares de la regeneración10.

Finalmente nuestro método de corte produce un enorme agujero de varios órdenes de magnitud mayor que la punción punto de terminales que se utiliza en un estudio reciente ^17, sin embargo, ambas heridas se curan en torno a 6 horas. Documentación de las fases visualmente llamativas y distintas de cierre de la herida debe sugerir enfoques experimentales para explicar la aparente independencia del tamaño de una herida y el tiempo que toma para cerrar. Por lo tanto, una comprensión visual más profunda del proceso de amputación aboral, proporcionada por este protocolo, ayudará a nuevas investigaciones sobre este sistema de regeneración de modelo y de ampliar la aplicación de este sistema de estadificación usando Nematostella vectensis.

Protocol

1. Acondicionamiento de animales con la temperatura, la nutrición y la Luz del ciclo oscuro / Obtener adultos Nematostella vectensis de uno de los numerosos laboratorios de todo el mundo Nematostella, o un proveedor sin fines de lucro (Tabla 1) Mantener Nematostella a temperatura constante (típicamente entre 18 y 21 ° C) en la oscuridad, en "1 / 3x" Artificial Agua de Mar (ASW) a una salinidad de 12 partes por mil (ppt). Mantener los cultivos …

Representative Results

La progresión de los acontecimientos morfológicos durante la regeneración en Physa cortada se muestra en la Figura 1A, que incluye vistas representativas de Physa en cada etapa NRSS. El sitio típico Physa corte se indica en el adulto (puntas de flecha). Las fotografías muestran en la Figura 1A regeneración progresiva de las estructuras orales y corporales de Physa recién cortada a través de pólipos completamente formado. Figura 1B, C</st…

Discussion

El uso de Nematostella como modelo de curación y regeneración de la herida se está convirtiendo cada vez más popular. Por lo tanto, es importante ser capaz de visualizar los patrones morfológicos de un protocolo particular antes de los análisis celulares y moleculares eficaces pueden ser asignados y comparación. Nematostella tener un alto grado de regeneración "flexibilidad", siendo capaz de reformar casi cualquier estructura que falta amputada en cualquier lugar, en las etapas poster…

Materials

Nematostella vectensis, adults	Marine Biological Lab (MBL)		non-profit supplier
Glass Culture Dish, 250 ml	Carolina Biological Supply	741004	250 ml
Glass Culture Dish, 1,500 ml	Carolina Biological Supply	741006	1,500 ml
Polyethylene transfer pipette, 5ml	USA Scientific	1022-2500	narrow bore, graduated
Polyethylene transfer pipet, tapered	Samco	202-205	cut off 1 inch of tip to make wide bore
Disposable Scalpel	Feather Safety Razor Co. Ltd	no. 10	blade should be curved
#5 Dumont Fine point tweezers	Roboz	RS5045	alternative suppliers available
Pyrex petri dish, 100 mm diameter	Corning	3160	can substitute other glass petri plates
Sterile 6 well plate	Corning Falcon	353046	or similar from other manufacturer
Sterile 12 well plate	Nunc	150628	or similar from other manufacturer
Sterile 24 well plate	Cellstar, Greiner bio-one	662-160	or similar from other manufacturer
Brine shrimp hathery kit	San Francisco Bay; drsfostersmith.com	CD-154005	option for growing brine shrimp
pyrex baking dish	common in grocery stores		option for growing brine shrimp
artificial seawater mix 50 gal or more	Instant Ocean; drsfoster-smith.com	CD-116528	others brands may suffice
Plastic tub for stock ASW preparation	various		common 25 gallon plastic trash can OK
Polypropylene Carboy	Carolina Biological Supply	716391	For working stock of ASW @ 12 ppt
Beaker, Graduated, 4,000ml	PhytoTechnology Laboratories	B199	For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt
Stereomicroscope and light source	various		with continuous 1 – 40x magnification