Montaj ve 'Kayma Rings' Uygulama: Orbital tek yönlü ve Periyodik Akışkan Akışının ve Kayma Stres için Yeni Bir Endotel Modeli
Summary
Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of ‘shear rings’: a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.
Abstract
uyarlanabilir yanı sıra endotel fenotip ve gen ifadesinde patolojik değişiklikleri uyararak normal seviyelerde ve vasküler fizyoloji ve patofizyoloji vasküler sıvı kayma oyun önemli rol modellerinden sapmalar. Özel olarak, periyodik olarak, tek yönlü akış kaynaklı kesme geriliminin uyumsuz etkileri birçok vasküler hücre tiplerinin, özellikle de endotel hücreler üzerindeki etkileri, çeşitli tetikleyebilir. Artık farklı anatomik kökenlerden gelen endotel hücreleri kültüre edilmiş ise, derinlemesine sıvı kesme onların tepkileri kesme modelleri göreli karmaşıklığı nedeniyle sekteye edilmiş analizleri (örneğin, paralel plaka akış odası, koni ve plaka akış modeli). bunların hepsi mükemmel yaklaşımları temsil ederken, bu tür modeller bot zorluklar yaratarak, teknik olarak karmaşık ve nispeten uzun ve karmaşık kurulum süresi, düşük yüzey alanları, genellikle sızdırmazlık ve conta gerektiren pompa ve basınçlandırma için gereklilikler dahil sakıncaları muzdaripsterilite ve birden fazla deneyler çalıştırmak için bir yetersizlik h bakımı. akış ve kesme yüksek verim modelleri vasküler endotelyal kayma tepkileri daha büyük bir ilerleme, kullanılabilir, ancak, moleküler seviyede, özellikle periyodik kesme araştırma, daha hızlı bir şekilde gelişmiş olabilir. kolayca tek yönlü, periyodik kayma gerilmesi çalışmalarında deneysel çoğaltır sayısının yüksek sağlayan nispeten geniş bir yüzey alanına sahip bir roman, basit-için bir araya, ve ucuz doku kültürü modeli: Burada, inşaat ve kullanım kayma halkaları tarif endotel hücreleri.
Introduction
Cis-düzenleyici elemanlar 6 aktivasyonu, histon asetiltransferaz aktivitesi 7 ve kesilme baskısı tepki elemanları (SSRE) Şekiller 5 ila 8 – Sıvı kesme stresi endotel gen Programlar 1 modüle ettiği gösterilmiştir. Doku faktörü 9 ve doku plazminojen aktivatörü (tPA) 10 ifadesini modüle ederek stres etkilere koagülasyon doğru endotel katkıları Kayma. Kayma gerilmesi de PDGF-B sentezini ve yanıt 8 düzenleyerek anjiyogenez 11 ve damar yeniden kontrolünü etkiler. Endotel, endotelin-1, Ürotensin II ve relaxin da makaslama 12 ile vazoaktif mediyatörler Adrenomedullin düzenlenir türetilmiş. Endotelyal nitrik oksit sentaz üretimi ve nitrik oksit üretimi transkripsiyonu hem kesme bağımlı 10 vardır. Kayma endotel ICAM-1 ifadesini 13 kontrol eder. Bu nedenle powerfu olabilir Akış kaynaklı kayma gerilmesilly endotelyal yanıtları çok çeşitli etkiler. Önemlisi, vasküler titreşimler şimdi de vasküler demans 14 hem normal vasküler yaşlanmanın ve formların patofizyolojisinde önemli rol oynuyor gibi görünmektedir ve hatta multipl skleroz 15 gibi diğer nörodejeneratif hastalıklar, katkıda bulunabilir.
Venöz ve arteriyel endotel hücreleri doğal olarak in vivo çeşitli hemodinamik akış modelleri maruz ve birçok farklı endotel hücre fenotipleri 16 sergilenebilir. Büyüklüğü ve akış periyodu bağlı olarak, endotel hücreleri üzerindeki etkileri, gen veya protein ekspresyonu 17,18 değişiklikleri yansıtır enflamatuar hücre aktivasyon ve apoptoz içerebilir. Endotel hücre yanıtlarının ilgili çalışmalar yeterli gibi kesme kalıpları üretmek in vitro modellerinin üretiminde bu nedenle zorluklar ile komplike kalır olayları kayma.
Birçok farklı experimental protokoller, hücre mono tabakaları endotel sıvı kayma gerilimi uygulama geliştirilmiştir. 21 – En sık kullanılan sistemlerden biridir odasının 19 içinde üniforma laminer akış oluşturur paralel plaka akış odası vardır. Bir peristaltik pompa tipik olarak in vivo 22 birçok yerlerde bulunan akış karakteristiklerini özetlemek olabilir periyodik akışı oluşturmak için bağlanır. Başka bir ortak kurulum sıvı kayma gerilmesi koni 23 dönme hızı ile belirlenir 'koni ve plaka' modeli kullanır. Onlara benzer Her iki sistem de, ve diğer düzenlemeler, kurmak ve birçok laboratuvar nispeten pahalı ve ulaşılmaz olabilir bileşenleri gerektiren sıkıcı olabilir.
Bu mevcut model bir diğer önemli bir sınırlama aynı zamanda nispeten düşük bir yüzey alanı olan, her biri gerçekleştirilebilir tekrarlanan çalışmalar nispeten düşük bir sayıdır. Bu zaman ve co artırır Bu tür yaklaşımların mplexity. Bu nedenle, tek yönlü ve periyodik kesme indükleyen ideal bir model nispeten geniş bir yüzey alanına sahip bir çalışma tekrardan yüksek sayıda kolayca ayarlanabilir bir, her olabilir. Bunun yanında söz konusu modellerin birçok kullanıcı için maliyet-engelleyici olabilir oldukça sofistike bir kurulum gerektirir. Temel laboratuvar malzemeleri kullanarak sıvı kayma bozuklukları üretebilen bir model çeşitli avantajları olabilir.
Tek yönlü, periyodik kesme gerilim uygulamak için basit ve son derece ekonomik bir yöntem bir orbital çalkalayıcıda 24 dairesel yemekler yerleştirilmesini içerir. Bu protokol çok basit ve gerektiği gibi çoğaltır çalışmanın yüksek sayıda, nispeten geniş bir yüzey alanına sahip her başarmak kadar ölçeklendirilebilir. Ancak, çanak merkezinde bulunan hücreler aynı çanak karışık hücresel fenotipik yanıtları veren, çevresi boyunca hücrelere göre farklı akış modelleri maruz kalmaktadır.
_content "> Bu akım yazıda, 'kesme halkaları', tek yönlü ve periyodik kayma gerilimi oluşturmak için model inşaat ve kullanımını tanımlamak. tasarım kesme halkası için etkili bir sınırlar" karma "hücresel kesme kaynaklı fenotipleri akışını kısıtlayarak bir iç halka yerleştirme ile çevresine dairesel kültür kabı içinde yolu. kayma halkası yapımı ve kullanımı basit ve ekonomiktir ve kolayca yaygın olarak kullanılan doku kültürü malzemeleri kullanarak yörünge shakers geniş bir yelpazede karşılamak için ölçeklenebilir. Bu Model, fizyolojik ve patofizyolojik seviyelerde tek yönlü ve periyodik akış modelleri temin etmek endotel hücre deneylerinde uygulanabilir.Protocol
Representative Results
Discussion
kesme endotel hücrelerini sergilemek için kesme halka sisteminin inşaat kayma gerilmesi çalışmalar yapmak için basit bir yaklaşımdır. Bununla birlikte, üstün kesme yüzük ve daha iyi sonuçlar elde etmek için kritik olan birkaç adım vardır. Tam bir mühür örnekleri arasında tutarsız kayma gerilmesi oluşturabilir sızıntı medyayı engellemek için iç ve dış halka arasındaki yapılmalıdır. Tam bir conta yapılmaması halinde, metilen klorid az miktarda iç halka delikten bir transfer pipetiyl…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Sayın Christopher Nguyen, Aaron Hunter ve Shreveport Jumpstart'a, SMART ve Biostart eğitim programlarının yardımı yanı sıra Biyofizik, Shreveport, LA Yüzüncü Koleji Louisiana bölümü kabul etmek istiyorum.
Materials
| 100 x 20 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430167 | The dishes must be polystyrene |
| 150 x 25 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430599 | The dishes must be polystyrene |
| 150 mm glass petri dish | Fisher | 3160150BO | |
| 15ml polystyrene tissue culture plastic tubes | Falcon | 352099 | |
| Methylene chloride | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| silicone rubber sealant | DAP | 7079808641 | |
| ethanol | Decon | 2701 | |
| 3 mL transfer pipette | Becton-Dickinson | 357524 | |
| printer paper | |||
| scissors | |||
| gloves | |||
| rotary tool and set | Dremel | 4000-6/50 | |
| rotary tool cutting head | Dremel | EZ476 | |
| rotary tool drill head | |||
| distilled water | |||
| orbital shaker | VWR | 57018-754 | |
| incubator | |||
| Rat retinal microvascular endothelial cells | Cell Biologics | RA-6065 |
References
- Resnick, N., Gimbrone, M. A. Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression. FASEB J. 9 (10), 874-882 (1995).
- Malek, A. M., Izumo, S. Control of endothelial cell gene expression by flow. J Biomech. 28 (12), 1515-1528 (1995).
- Ando, J., Kamiya, A. Flow-dependent Regulation of Gene Expression in Vascular Endothelial Cells. Jpn Heart J. 37 (1), 19-32 (1996).
- Resnick, N., Yahav, H., et al. Endothelial Gene Regulation by Laminar Shear Stress. Adv Exp Med Biol. 430, 155-164 (1997).
- Gaucher, C., et al. In vitro impact of physiological shear stress on endothelial cells gene expression profile. Clin Hemorheol Mico. 37 (1-2), 99-107 (2007).
- Fisslthaler, B., et al. Identification of a cis -Element Regulating Transcriptional Activity in Response to Fluid Shear Stress in Bovine Aortic Endothelial Cells. Endothelium-J Endoth. 10 (4-5), 267-275 (2003).
- Chen, W., Bacanamwo, M., Harrison, D. G. Activation of p300 Histone Acetyltransferase Activity Is an Early Endothelial Response to Laminar Shear Stress and Is Essential for Stimulation of Endothelial Nitric-oxide Synthase mRNA Transcription. J Biol Chem. 283 (24), 16293-16298 (2008).
- Sumpio, B. E., et al. Regulation of PDGF-B in Endothelial Cells Exposed to Cyclic Strain. Arterioscl Throm Vas. 18 (3), 349-355 (1998).
- Yang, Y., et al. Triplex-forming oligonucleotide inhibits the expression of tissue factor gene in endothelial cells induced by the blood flow shear stress in rats. Acta Pharm Sinic. 41 (9), 808-813 (2006).
- Sumpio, B. E., Chang, R., Xu, W. -. J., Wang, X. -. J., Du, W. Regulation of tPA in endothelial cells exposed to cyclic strain: role of CRE, AP-2, and SSRE binding sites. Am J Physiol. 273 (5 Pt 1), C1441-C1448 (1997).
- Silberman, M., et al. Shear stress-induced transcriptional regulation via hybrid promoters as a potential tool for promoting angiogenesis. Nato Adv Sci Inst Se. 12 (3), 231-242 (2009).
- Dschietzig, T., et al. Flow-induced pressure differentially regulates endothelin-1, urotensin II, adrenomedullin, and relaxin in pulmonary vascular endothelium. Biochem Biophys Res Commun. 289 (1), 245-251 (2001).
- Nagel, T., Resnick, N., Atkinson, W. J., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Shear stress selectively upregulates intercellular adhesion molecule-1 expression in cultured human vascular endothelial cells. J Clin Invest. 94 (2), 885-891 (1994).
- Bateman, G. A., Levi, C. R., Schofield, P., Wang, Y., Lovett, E. C. The venous manifestations of pulse wave encephalopathy: windkessel dysfunction in normal aging and senile dementia. Neuroradiology. 50 (6), 491-497 (2008).
- Juurlink, B. H. J. Is there a pulse wave encephalopathy component to multiple sclerosis. Curr Neurovasc Res. 12 (2), 199-209 (2015).
- Topper, J. N., Gimbrone, M. A. Blood flow and vascular gene expression: fluid shear stress as a modulator of endothelial phenotype. Mol Med Today. 5 (1), 40-46 (1999).
- Tzima, E., et al. A mechanosensory complex that mediates the endothelial cell response to fluid shear stress. Nature. 437 (7057), 426-431 (2005).
- Li, Y. -. S. J., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J Biomech. 38 (10), 1949-1971 (2005).
- Reinhart-King, C. A., Fujiwara, K., Berk, B. C. Physiologic Stress-Mediated Signaling in the Endothelium. Method Enzymol. 443, 25-44 (2008).
- Frangos, J. A., McIntire, L. V., Eskin, S. G. Shear stress induced stimulation of mammalian cell metabolism. Biotechnol Bioeng. 32 (8), 1053-1060 (1988).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress. J Vis Exp. (59), (2012).
- Reinitz, A., DeStefano, J., Ye, M., Wong, A. D., Searson, P. C. Human brain microvascular endothelial cells resist elongation due to shear stress. Microvasc Res. 99, 8-18 (2015).
- Dewey, C. F., Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A., Davies, P. F. The Dynamic Response of Vascular Endothelial Cells to Fluid Shear Stress. J Biomed Eng. 103 (3), 177 (1981).
- Dardik, A., et al. Differential effects of orbital and laminar shear stress on endothelial cells. J Vasc Surg. 41 (5), 869-880 (2005).
- Honda, S., et al. Ligand-induced adhesion to activated endothelium and to vascular cell adhesion molecule-1 in lymphocytes transfected with the N-formyl peptide receptor. J Immunol. 152 (8), 4026-4035 (1994).
- Watt, S. M., Gschmeissner, S. E., Bates, P. A. PECAM-1: its expression and function as a cell adhesion molecule on hemopoietic and endothelial cells. Leukemia Lymphoma. 17 (3-4), 229-244 (1995).
- Fujiwara, K. Platelet endothelial cell adhesion molecule-1 and mechanotransduction in vascular endothelial cells. J Intern Med. 259 (4), 373-380 (2006).
- Dusserre, N. PECAM-1 Interacts With Nitric Oxide Synthase in Human Endothelial Cells: Implication for Flow-Induced Nitric Oxide Synthase Activation. Arterioscl Throm Vas. 24 (10), 1796-1802 (2004).
- Bagi, Z. PECAM-1 Mediates NO-Dependent Dilation of Arterioles to High Temporal Gradients of Shear Stress. Arterioscl Throm Vas. 25 (8), 1590-1595 (2005).
