الجمعية وتطبيق "خواتم القص ': رواية غشائي نموذج لالمداري، أحادي الاتجاه والدوري السائل تدفق وإجهاد القص
Summary
Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of ‘shear rings’: a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.
Abstract
الانحرافات عن المستويات الطبيعية وأنماط القص لعب أدوارا هامة السوائل الأوعية الدموية في علم وظائف الأعضاء الأوعية الدموية والفيزيولوجيا المرضية عن طريق إحداث التكيف فضلا عن التغيرات المرضية في النمط الظاهري البطانية والتعبير الجيني. على وجه الخصوص، يمكن أن آثار غير القادرة على التأقلم من الدوري، وتدفق في اتجاه وإجهاد القص الناجمة تؤدي مجموعة متنوعة من الآثار في العديد من أنواع الخلايا الأوعية الدموية، وخاصة الخلايا البطانية. بينما الآن كانت الخلايا البطانية من أصول التشريحية المختلفة مثقف، تحليلات متعمقة من تعرقلت ردودها على القص السوائل عن طريق تعقيد النسبي للنماذج القص (على سبيل المثال، وبالتوازي مع غرفة التدفق لوحة، والمخروط ونموذج التدفق لوحة). في حين أن هذه تمثل كلها أساليب ممتازة ومثل هذه النماذج معقدة من الناحية الفنية وتعاني من عيوب بما في ذلك وقت الإعداد طويلة ومعقدة نسبيا، والمناطق السطحية منخفضة، ومتطلبات المضخات والضغط تتطلب المواد المانعة للتسرب وحشيات في كثير من الأحيان، وخلق تحديات بوتصيانة ح من العقم وعدم القدرة على تشغيل تجارب متعددة. ومع ذلك، إذا كانت نماذج ارتفاع الناتج من تدفق والقص المتاحة، مزيد من التقدم على الردود القص بطانة الأوعية الدموية، والبحوث القص الدوري وخصوصا على المستوى الجزيئي، قد يكون أكثر تقدما سريعا. هنا، نحن تصف بناء واستخدام حلقات القص: رواية، بسيطة إلى التجمع، وغير مكلفة نموذج زراعة الأنسجة مع مساحة كبيرة نسبيا الذي يسمح بسهولة لعدد كبير من مكررات التجريبية في، القص الدوري الدراسات الضغط أحادي الاتجاه على الخلايا البطانية.
Introduction
وقد تبين إجهاد القص السوائل لتعديل برامج الجين البطانية 1-5 من خلال تفعيل عناصر رابطة الدول المستقلة التنظيمية 6، هيستون النشاط أسيتيل 7 و عناصر الاستجابة للضغط النفسي القص (SSRE) 8. القص تأثيرات الإجهاد المساهمات البطانية نحو تجلط الدم عن طريق تحوير العامل النسيجي 9 و منشط البلازمينوجين النسيجي (TPA) 10 التعبير. يؤثر إجهاد القص أيضا السيطرة على الأوعية الدموية 11 وإعادة السفينة التي تنظم تخليق PDGF-B والاستجابة 8. البطانية مشتقة سطاء فعال في الأوعية adrenomedullin، endothelin-1، وينظم urotensin الثاني والريلاكسين أيضا القص 12. النسخ من البطانية النيتريك إنتاج أكسيد سينسيز وإنتاج أكسيد النيتريك على حد سواء القص يعتمد 10. كما تسيطر القص البطانية ICAM-1 التعبير 13. القص الإجهاد الناجم عن التدفق وبالتالي يمكن powerfuالتأثير LLY مجموعة كبيرة ومتنوعة من الاستجابات البطانية. الأهم من ذلك، نبضات الأوعية الدموية الآن تظهر أيضا أن تلعب أدوارا هامة في الفيزيولوجيا المرضية لكلا شيخوخة الأوعية الدموية الطبيعية وأشكال الخرف الوعائي 14 ويمكن أن تسهم حتى الأمراض العصبية الأخرى، مثل التصلب المتعدد 15.
وكشفت الوريدية والشريانية الخلايا البطانية بطبيعتها إلى أنماط تدفق الدورة الدموية المختلفة في الجسم الحي، والعديد من مختلف الظواهر الخلايا البطانية يمكن أظهرت 16. اعتمادا على حجم ووتيرة تدفق، ويمكن أن تشمل التأثيرات على الخلايا البطانية تنشيط الخلايا الالتهابية وموت الخلايا المبرمج، والتي قد تعكس التغيرات في الجينات أو البروتين التعبير 17،18. دراسات عن مدى استجابة الخلايا البطانية للقص الظواهر بالتالي تبقى معقدة من جراء الصعوبات في إنتاج نماذج في المختبر التي تنتج بشكل كاف مثل هذه الأنماط القص.
العديد من experime مختلفةوقد وضعت بروتوكولات ntal لتطبيق إجهاد القص السائل إلى البطانية الطبقات الوحيدة الخلية. أحد أنظمة الأكثر شيوعا هي موازية غرفة التدفق لوحة، مما يخلق تدفق الصفحي موحد داخل غرفة 19-21. وعادة ما يتم توصيل مضخة تحوي لخلق تدفق الدوري، والتي يمكن تلخيص خصائص التدفقات التي توجد عادة في العديد من المواقع في الجسم الحي 22. يستخدم المشترك انشاء أخرى في "مخروط ولوحة" نموذج، حيث يتم تحديد إجهاد القص السوائل عن طريق سرعة دوران مخروط 23. كلا النظامين، وترتيبات أخرى مشابهة لها، ويمكن أن تكون مملة لانشاء وتتطلب المكونات التي يمكن أن تكون مكلفة نسبيا وبعيدة عن متناول العديد من المختبرات.
قيدا رئيسيا آخر من هذه النماذج الحالية هو عدد قليل نسبيا من الدراسات تكرار التي يمكن القيام بها في وقت واحد، ولكل منها مساحة منخفضة نسبيا. وهذا يزيد من الوقت والتعاون mplexity هذه النهج. لذلك، وهو نموذج مثالي أن يدفع القص أحادي الاتجاه والدوري قد يكون واحدا حيث عدد كبير من مكررات الدراسة يمكن تعيين ما يصل بسهولة، ولكل منها مساحة كبيرة نسبيا. وعلاوة على ذلك، فإن النماذج المذكورة أعلاه تتطلب الإعداد متطورة إلى حد ما، والتي قد تكون باهظة التكلفة بالنسبة لكثير من المستخدمين. نموذج التي يمكن أن تنتج اضطرابات القص السوائل باستخدام المواد المختبرية الأساسية قد يكون العديد من المزايا.
وهناك طريقة بسيطة واقتصادية للغاية تطبيق أحادي الاتجاه، إجهاد القص الدوري ينطوي على وضع أطباق دائرية على شاكر المداري 24. هذا البروتوكول هو بسيط جدا ويمكن زيادتها إلى تحقيق أرقام عالية من الدراسة يعيد، ولكل منها مساحة كبيرة نسبيا، حسب الحاجة. ومع ذلك، تتعرض الخلايا تقع في وسط الطبق لأنماط التدفق مختلفة من الخلايا على امتداد المحيط الخارجي، مما أسفر عن ردود المظهرية الخلوية مختلطة في نفس الطبق.
_content "> في هذا التقرير الحالي، نحن تصف بناء واستخدام" حلقات القص، لدينا نموذج لخلق إجهاد القص أحادي الاتجاه والدوري، وتصميم لحلقة القص بشكل فعال حدود "مختلطة" الظواهر التي يسببها القص الخلوية عن طريق تقييد تدفق المسار داخل طبق ثقافة التعميم إلى المحيط من خلال وضع الحلقة الداخلية، وبناء وتشغيل الحلقة القص هو بسيط واقتصادي ويمكن زيادتها بسهولة لاستيعاب مجموعة واسعة من الهزازات المدارية باستخدام المتاحة على نطاق واسع لوازم زراعة الأنسجة. هذا نموذج يمكن تطبيقه في تجارب الخلايا البطانية لتوفير أنماط تدفق أحادي الاتجاه والدورية ضمن مستويات الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض.Protocol
Representative Results
Discussion
بناء على نظام عصابة القص لتعريض الخلايا البطانية القص هو نهج بسيط لإجراء الدراسات إجهاد القص. ومع ذلك، هناك بعض الخطوات التي تعتبر بالغة الأهمية للحصول على حلقات القص العالية ونتائج أفضل. وينبغي بذل ختم كاملة بين الحلبة الداخلية والخارجية لمنع وسائل الإعلام من تسري?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أن نعترف المساعدة من السيد كريستوفر نغوين، هارون هنتر وويزيانا في Jumpstart، سمارت، وبرامج التدريب Biostart فضلا عن قسم بمئوية كلية ولاية لويزيانا من الفيزياء الحيوية، ويزيانا، لوس انجليس.
Materials
| 100 x 20 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430167 | The dishes must be polystyrene |
| 150 x 25 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430599 | The dishes must be polystyrene |
| 150 mm glass petri dish | Fisher | 3160150BO | |
| 15ml polystyrene tissue culture plastic tubes | Falcon | 352099 | |
| Methylene chloride | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| silicone rubber sealant | DAP | 7079808641 | |
| ethanol | Decon | 2701 | |
| 3 mL transfer pipette | Becton-Dickinson | 357524 | |
| printer paper | |||
| scissors | |||
| gloves | |||
| rotary tool and set | Dremel | 4000-6/50 | |
| rotary tool cutting head | Dremel | EZ476 | |
| rotary tool drill head | |||
| distilled water | |||
| orbital shaker | VWR | 57018-754 | |
| incubator | |||
| Rat retinal microvascular endothelial cells | Cell Biologics | RA-6065 |
References
- Resnick, N., Gimbrone, M. A. Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression. FASEB J. 9 (10), 874-882 (1995).
- Malek, A. M., Izumo, S. Control of endothelial cell gene expression by flow. J Biomech. 28 (12), 1515-1528 (1995).
- Ando, J., Kamiya, A. Flow-dependent Regulation of Gene Expression in Vascular Endothelial Cells. Jpn Heart J. 37 (1), 19-32 (1996).
- Resnick, N., Yahav, H., et al. Endothelial Gene Regulation by Laminar Shear Stress. Adv Exp Med Biol. 430, 155-164 (1997).
- Gaucher, C., et al. In vitro impact of physiological shear stress on endothelial cells gene expression profile. Clin Hemorheol Mico. 37 (1-2), 99-107 (2007).
- Fisslthaler, B., et al. Identification of a cis -Element Regulating Transcriptional Activity in Response to Fluid Shear Stress in Bovine Aortic Endothelial Cells. Endothelium-J Endoth. 10 (4-5), 267-275 (2003).
- Chen, W., Bacanamwo, M., Harrison, D. G. Activation of p300 Histone Acetyltransferase Activity Is an Early Endothelial Response to Laminar Shear Stress and Is Essential for Stimulation of Endothelial Nitric-oxide Synthase mRNA Transcription. J Biol Chem. 283 (24), 16293-16298 (2008).
- Sumpio, B. E., et al. Regulation of PDGF-B in Endothelial Cells Exposed to Cyclic Strain. Arterioscl Throm Vas. 18 (3), 349-355 (1998).
- Yang, Y., et al. Triplex-forming oligonucleotide inhibits the expression of tissue factor gene in endothelial cells induced by the blood flow shear stress in rats. Acta Pharm Sinic. 41 (9), 808-813 (2006).
- Sumpio, B. E., Chang, R., Xu, W. -. J., Wang, X. -. J., Du, W. Regulation of tPA in endothelial cells exposed to cyclic strain: role of CRE, AP-2, and SSRE binding sites. Am J Physiol. 273 (5 Pt 1), C1441-C1448 (1997).
- Silberman, M., et al. Shear stress-induced transcriptional regulation via hybrid promoters as a potential tool for promoting angiogenesis. Nato Adv Sci Inst Se. 12 (3), 231-242 (2009).
- Dschietzig, T., et al. Flow-induced pressure differentially regulates endothelin-1, urotensin II, adrenomedullin, and relaxin in pulmonary vascular endothelium. Biochem Biophys Res Commun. 289 (1), 245-251 (2001).
- Nagel, T., Resnick, N., Atkinson, W. J., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Shear stress selectively upregulates intercellular adhesion molecule-1 expression in cultured human vascular endothelial cells. J Clin Invest. 94 (2), 885-891 (1994).
- Bateman, G. A., Levi, C. R., Schofield, P., Wang, Y., Lovett, E. C. The venous manifestations of pulse wave encephalopathy: windkessel dysfunction in normal aging and senile dementia. Neuroradiology. 50 (6), 491-497 (2008).
- Juurlink, B. H. J. Is there a pulse wave encephalopathy component to multiple sclerosis. Curr Neurovasc Res. 12 (2), 199-209 (2015).
- Topper, J. N., Gimbrone, M. A. Blood flow and vascular gene expression: fluid shear stress as a modulator of endothelial phenotype. Mol Med Today. 5 (1), 40-46 (1999).
- Tzima, E., et al. A mechanosensory complex that mediates the endothelial cell response to fluid shear stress. Nature. 437 (7057), 426-431 (2005).
- Li, Y. -. S. J., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J Biomech. 38 (10), 1949-1971 (2005).
- Reinhart-King, C. A., Fujiwara, K., Berk, B. C. Physiologic Stress-Mediated Signaling in the Endothelium. Method Enzymol. 443, 25-44 (2008).
- Frangos, J. A., McIntire, L. V., Eskin, S. G. Shear stress induced stimulation of mammalian cell metabolism. Biotechnol Bioeng. 32 (8), 1053-1060 (1988).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress. J Vis Exp. (59), (2012).
- Reinitz, A., DeStefano, J., Ye, M., Wong, A. D., Searson, P. C. Human brain microvascular endothelial cells resist elongation due to shear stress. Microvasc Res. 99, 8-18 (2015).
- Dewey, C. F., Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A., Davies, P. F. The Dynamic Response of Vascular Endothelial Cells to Fluid Shear Stress. J Biomed Eng. 103 (3), 177 (1981).
- Dardik, A., et al. Differential effects of orbital and laminar shear stress on endothelial cells. J Vasc Surg. 41 (5), 869-880 (2005).
- Honda, S., et al. Ligand-induced adhesion to activated endothelium and to vascular cell adhesion molecule-1 in lymphocytes transfected with the N-formyl peptide receptor. J Immunol. 152 (8), 4026-4035 (1994).
- Watt, S. M., Gschmeissner, S. E., Bates, P. A. PECAM-1: its expression and function as a cell adhesion molecule on hemopoietic and endothelial cells. Leukemia Lymphoma. 17 (3-4), 229-244 (1995).
- Fujiwara, K. Platelet endothelial cell adhesion molecule-1 and mechanotransduction in vascular endothelial cells. J Intern Med. 259 (4), 373-380 (2006).
- Dusserre, N. PECAM-1 Interacts With Nitric Oxide Synthase in Human Endothelial Cells: Implication for Flow-Induced Nitric Oxide Synthase Activation. Arterioscl Throm Vas. 24 (10), 1796-1802 (2004).
- Bagi, Z. PECAM-1 Mediates NO-Dependent Dilation of Arterioles to High Temporal Gradients of Shear Stress. Arterioscl Throm Vas. 25 (8), 1590-1595 (2005).
