De Algemene Vergadering en de toepassing van 'Shear Rings': A Novel endotheliale Model voor Orbital, Unidirectionele en Periodieke Fluid Flow en Shear Stress
Summary
Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of ‘shear rings’: a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.
Abstract
Afwijkingen van normale niveaus en patronen van vasculaire vloeistof shear spelen een belangrijke rol in vasculaire fysiologie en pathofysiologie door inductie adaptieve en pathologische veranderingen in endotheliale fenotype en genexpressie. In het bijzonder kan maladaptive effecten van periodieke unidirectionele stroming veroorzaakte afschuifspanning diverse effecten op vasculaire verschillende celtypes, met name endotheelcellen activeren. Hoewel inmiddels endotheelcellen van verschillende anatomische afkomst zijn gekweekt, diepgaande analyses van hun antwoorden op vloeistof shear werden gehinderd door de relatieve complexiteit van de shear modellen (bijvoorbeeld parallelle plaat stroom kamer, kegel en plaat flow model). Hoewel deze allemaal uitstekend benaderingen vertegenwoordigen dergelijke modellen technisch ingewikkeld en lijden aan nadelen waaronder relatief lange en ingewikkelde insteltijd, geringe oppervlak eisen voor pompen en druk brengen waarvoor vaak afdichtingsmiddelen en pakkingen, waardoor uitdagingen both steriliteit te handhaven en een onvermogen om meerdere experimenten uitgevoerd. Wanneer hogere doorvoersnelheid modellen van stroming en afschuiving beschikbaar, meer vooruitgang op vasculaire endotheliale shear reacties waren bijzonder periodieke afschuiving onderzoek op moleculair niveau, kan sneller gevorderd zijn. Hier beschrijven we de bouw en het gebruik van de shear ringen: een nieuwe, eenvoudig te monteren, en goedkope weefselkweek model met een relatief groot oppervlak dat gemakkelijk zorgt voor een hoog aantal experimentele herhalingen in één richting, periodieke shear stress studies over endotheel cellen.
Introduction
Vloeistof shear stress is aangetoond dat endotheelcellen gen moduleren's 1-5 door activatie van cis-regulerende elementen 6, histone acetyltransferase-activiteit 7 en schuifspanning respons elementen (SSRE) 8. Afschuifspanning invloeden endotheliale bijdragen voor coagulatie door het moduleren weefselfactor 9 en weefselplasminogeenactivator (tPA) 10 expressie. Shear stress beïnvloedt ook de controle van angiogenese 11 en vat remodeling door het reguleren van PDGF-B-synthese en het reactievermogen 8. Het endotheel afgeleide vasoactieve mediatoren adrenomedullin, endotheline-1, urotensine II en relaxin worden ook geregeld door afschuiving 12. Transcriptie van endotheel stikstofoxide synthase productie en de productie van stikstofoxide zijn beide shear afhankelijk 10. Shear controleert ook endotheliale ICAM-1-expressie 13. Stromingsgeïnduceerde shear stress kan dus powerfully kracht een grote verscheidenheid aan endotheliale responsen. Belangrijker vasculaire pulsaties nu ook blijken belangrijke rol spelen in de pathofysiologie van zowel normale vasculaire veroudering en vormen van vasculaire dementie 14 en kan zelfs bijdragen aan andere neurodegeneratieve ziekten, zoals multiple sclerose 15.
Veneuze en arteriële endotheelcellen inherent blootgesteld aan diverse hemodynamische stromingspatronen in vivo, en veel verschillende endotheelcellen fenotypes kunnen worden tentoongesteld 16. Afhankelijk van de grootte en frequentie van stroming, kan effecten op endotheliale cellen omvatten ontstekingscellen activering en apoptose, die veranderingen in gen of eiwitexpressie 17,18 kunnen weerspiegelen. Studies op endotheliale celreacties op verschijnselen blijft derhalve gecompliceerd door de moeilijkheden afschuiven vervaardiging van in vitro modellen die adequaat produceren dergelijke afschuiving patronen.
Veel verschillende experimental protocollen ontwikkeld om vloeistof schuifspanning toepassing op endotheliale celmonolagen. Een van de meest gebruikte systemen is de parallelle plaat stroming kamer, die gelijkmatige laminaire stroming binnen de kamer 19 creëert – 21. Een peristaltische pomp is typisch verbonden met periodieke stroom, die stromingseigenschappen kenmerkend voor vele locaties in vivo 22 kan herhalen maken. Een andere gemeenschappelijke opstelling gebruikt het 'kegel en plaat-model, waarbij fluïdum afschuifspanning wordt bepaald door de rotatiesnelheid van de conus 23. Beide systemen, en andere soortgelijke regelingen hen kan vervelend zijn voor het opzetten en vereisen componenten die relatief duur en ontoegankelijk voor veel laboratoria kunnen worden.
Een andere belangrijke beperking van deze huidige modellen is het relatief lage aantal gelijke studies die gelijktijdig kunnen worden uitgevoerd, elk met een relatief klein oppervlak. Dit verhoogt de tijd en co mplexity van deze aanpak. Daarom zou een ideaal model unidirectionele en periodieke shear induceert een waar een groot aantal studie duplo eenvoudig worden ingesteld, elk met een relatief groot oppervlak. Bovendien, de eerder genoemde modellen vereisen een vrij geavanceerde setup, die kosten prohibitief kan zijn voor veel gebruikers. Een model dat shear verstoringen vloeistof kan produceren met behulp van elementaire laboratorium materialen kan enkele voordelen hebben.
Een eenvoudige en zeer voordelige wijze van aanbrengen unidirectionele periodieke afschuifspanning omvat het plaatsen van cirkelvormige schotels op een rondschudapparaat 24. Dit protocol is zeer eenvoudig en kan worden opgeschaald naar grote aantallen studie gerepliceerd, elk met een betrekkelijk groot oppervlak te bereiken, indien nodig. Cellen in het midden van de schaal worden blootgesteld aan verschillende stromingspatronen dan cellen langs de omtrek, waarbij gemengde cellulaire fenotypische responsen in dezelfde schotel.
_content "> In dit huidige rapport beschrijven we de bouw en het gebruik van 'shear ringen', ons model voor het creëren van één richting en periodieke shear stress. Het ontwerp voor de shear ring effectief 'mixed' cellulaire afschuiving geïnduceerde fenotypes grenzen door de stroming te beperken route in een cirkelvormige kweekschaal aan de omtrek door de plaatsing van een binnenring. de constructie en werking van de afschuifring eenvoudig en goedkoop en kan eenvoudig worden aangepast aan een breed scala van orbitale shakers geschikt gebruik van algemeen beschikbare weefselkweek voorraden. Deze model kan in endotheelcellen experimenten worden toegepast op één richting en periodieke stromingspatronen te bieden binnen de fysiologische en pathofysiologische niveaus.Protocol
Representative Results
Discussion
De constructie van de afschuiving ringsysteem voor het belichten endotheelcellen afschuiving is een eenvoudige benadering van het uitvoeren afschuifspanning studies. Toch zijn er enkele stappen die essentieel zijn voor het verkrijgen van superieure afschuiving ringen en betere resultaten. Een volledige afdichting moet worden gemaakt tussen de binnenste en buitenste ring om de media te voorkomen dat lekken die in strijd zijn shear stress onder samples zou kunnen leiden. Als een volledige afdichting uitblijft, slechts een…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag de hulp van de heer Christopher Nguyen, Aaron Hunter en de Shreveport Jumpstart, SMART, en biostart opleidingen evenals de Centenary College of Louisiana afdeling Biofysica, Shreveport, LA erkennen.
Materials
| 100 x 20 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430167 | The dishes must be polystyrene |
| 150 x 25 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430599 | The dishes must be polystyrene |
| 150 mm glass petri dish | Fisher | 3160150BO | |
| 15ml polystyrene tissue culture plastic tubes | Falcon | 352099 | |
| Methylene chloride | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| silicone rubber sealant | DAP | 7079808641 | |
| ethanol | Decon | 2701 | |
| 3 mL transfer pipette | Becton-Dickinson | 357524 | |
| printer paper | |||
| scissors | |||
| gloves | |||
| rotary tool and set | Dremel | 4000-6/50 | |
| rotary tool cutting head | Dremel | EZ476 | |
| rotary tool drill head | |||
| distilled water | |||
| orbital shaker | VWR | 57018-754 | |
| incubator | |||
| Rat retinal microvascular endothelial cells | Cell Biologics | RA-6065 |
References
- Resnick, N., Gimbrone, M. A. Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression. FASEB J. 9 (10), 874-882 (1995).
- Malek, A. M., Izumo, S. Control of endothelial cell gene expression by flow. J Biomech. 28 (12), 1515-1528 (1995).
- Ando, J., Kamiya, A. Flow-dependent Regulation of Gene Expression in Vascular Endothelial Cells. Jpn Heart J. 37 (1), 19-32 (1996).
- Resnick, N., Yahav, H., et al. Endothelial Gene Regulation by Laminar Shear Stress. Adv Exp Med Biol. 430, 155-164 (1997).
- Gaucher, C., et al. In vitro impact of physiological shear stress on endothelial cells gene expression profile. Clin Hemorheol Mico. 37 (1-2), 99-107 (2007).
- Fisslthaler, B., et al. Identification of a cis -Element Regulating Transcriptional Activity in Response to Fluid Shear Stress in Bovine Aortic Endothelial Cells. Endothelium-J Endoth. 10 (4-5), 267-275 (2003).
- Chen, W., Bacanamwo, M., Harrison, D. G. Activation of p300 Histone Acetyltransferase Activity Is an Early Endothelial Response to Laminar Shear Stress and Is Essential for Stimulation of Endothelial Nitric-oxide Synthase mRNA Transcription. J Biol Chem. 283 (24), 16293-16298 (2008).
- Sumpio, B. E., et al. Regulation of PDGF-B in Endothelial Cells Exposed to Cyclic Strain. Arterioscl Throm Vas. 18 (3), 349-355 (1998).
- Yang, Y., et al. Triplex-forming oligonucleotide inhibits the expression of tissue factor gene in endothelial cells induced by the blood flow shear stress in rats. Acta Pharm Sinic. 41 (9), 808-813 (2006).
- Sumpio, B. E., Chang, R., Xu, W. -. J., Wang, X. -. J., Du, W. Regulation of tPA in endothelial cells exposed to cyclic strain: role of CRE, AP-2, and SSRE binding sites. Am J Physiol. 273 (5 Pt 1), C1441-C1448 (1997).
- Silberman, M., et al. Shear stress-induced transcriptional regulation via hybrid promoters as a potential tool for promoting angiogenesis. Nato Adv Sci Inst Se. 12 (3), 231-242 (2009).
- Dschietzig, T., et al. Flow-induced pressure differentially regulates endothelin-1, urotensin II, adrenomedullin, and relaxin in pulmonary vascular endothelium. Biochem Biophys Res Commun. 289 (1), 245-251 (2001).
- Nagel, T., Resnick, N., Atkinson, W. J., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Shear stress selectively upregulates intercellular adhesion molecule-1 expression in cultured human vascular endothelial cells. J Clin Invest. 94 (2), 885-891 (1994).
- Bateman, G. A., Levi, C. R., Schofield, P., Wang, Y., Lovett, E. C. The venous manifestations of pulse wave encephalopathy: windkessel dysfunction in normal aging and senile dementia. Neuroradiology. 50 (6), 491-497 (2008).
- Juurlink, B. H. J. Is there a pulse wave encephalopathy component to multiple sclerosis. Curr Neurovasc Res. 12 (2), 199-209 (2015).
- Topper, J. N., Gimbrone, M. A. Blood flow and vascular gene expression: fluid shear stress as a modulator of endothelial phenotype. Mol Med Today. 5 (1), 40-46 (1999).
- Tzima, E., et al. A mechanosensory complex that mediates the endothelial cell response to fluid shear stress. Nature. 437 (7057), 426-431 (2005).
- Li, Y. -. S. J., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J Biomech. 38 (10), 1949-1971 (2005).
- Reinhart-King, C. A., Fujiwara, K., Berk, B. C. Physiologic Stress-Mediated Signaling in the Endothelium. Method Enzymol. 443, 25-44 (2008).
- Frangos, J. A., McIntire, L. V., Eskin, S. G. Shear stress induced stimulation of mammalian cell metabolism. Biotechnol Bioeng. 32 (8), 1053-1060 (1988).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress. J Vis Exp. (59), (2012).
- Reinitz, A., DeStefano, J., Ye, M., Wong, A. D., Searson, P. C. Human brain microvascular endothelial cells resist elongation due to shear stress. Microvasc Res. 99, 8-18 (2015).
- Dewey, C. F., Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A., Davies, P. F. The Dynamic Response of Vascular Endothelial Cells to Fluid Shear Stress. J Biomed Eng. 103 (3), 177 (1981).
- Dardik, A., et al. Differential effects of orbital and laminar shear stress on endothelial cells. J Vasc Surg. 41 (5), 869-880 (2005).
- Honda, S., et al. Ligand-induced adhesion to activated endothelium and to vascular cell adhesion molecule-1 in lymphocytes transfected with the N-formyl peptide receptor. J Immunol. 152 (8), 4026-4035 (1994).
- Watt, S. M., Gschmeissner, S. E., Bates, P. A. PECAM-1: its expression and function as a cell adhesion molecule on hemopoietic and endothelial cells. Leukemia Lymphoma. 17 (3-4), 229-244 (1995).
- Fujiwara, K. Platelet endothelial cell adhesion molecule-1 and mechanotransduction in vascular endothelial cells. J Intern Med. 259 (4), 373-380 (2006).
- Dusserre, N. PECAM-1 Interacts With Nitric Oxide Synthase in Human Endothelial Cells: Implication for Flow-Induced Nitric Oxide Synthase Activation. Arterioscl Throm Vas. 24 (10), 1796-1802 (2004).
- Bagi, Z. PECAM-1 Mediates NO-Dependent Dilation of Arterioles to High Temporal Gradients of Shear Stress. Arterioscl Throm Vas. 25 (8), 1590-1595 (2005).
