Die Montage und Anwendung der "Shear Ringe ': A Novel Endothelial Modell für Orbital, unidirektional und periodische Strömungs- und Scherspannung
Summary
Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of ‘shear rings’: a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.
Abstract
Abweichungen von normalen Niveaus und Muster der vaskulären Flüssigkeitsscher spielen eine wichtige Rolle in der Gefäß Physiologie und Pathophysiologie durch adaptive sowie pathologische Veränderungen der endothelialen Phänotyp und die Genexpression zu induzieren. Insbesondere maladaptiven Effekte von periodischen, unidirektionale Strömungs induzierte Scherbeanspruchung kann eine Vielfalt von Wirkungen auf verschiedene vaskuläre Zelltypen auszulösen, insbesondere Endothelzellen. Während mittlerweile Endothelzellen aus verschiedenen anatomischen Herkunft kultiviert worden sind, eingehende Analysen ihrer Reaktionen auf Fluid – Scher wurden durch die relative Komplexität der Schermodelle (zB Parallelplattenflusskammer, Kegel-Platte – Flow – Modell) behindert. Während diese alle guten Ansätze darstellen, sind solche Modelle technisch kompliziert und leiden unter den Nachteilen, einschließlich relativ langwierigen und komplexen Aufbauzeit, niedrige Oberflächenbereiche, Anforderungen für Pumpen und häufig Druck Dicht- und Dichtungen erfordern, Herausforderungen bot die Schaffungh Aufrechterhaltung der Sterilität und die Unfähigkeit, mehrere Experimente auszuführen. wenn ein höherer Durchsatz Modelle von Strömung und Scher jedoch zur Verfügung standen, größere Fortschritte bei der vaskulären endothelialen Scher Reaktionen, insbesondere periodische Scher Forschung auf molekularer Ebene könnte mehr sein, schnell vorangeschritten. Hier beschreiben wir den Aufbau und die Verwendung von Scherringe: a novel, einfach zu montieren und kostengünstig Gewebekultur-Modell mit einer relativ großen Oberfläche, die für eine hohe Zahl von experimentellen Replikate in einer Richtung, periodische Scherspannung Studien leicht ermöglicht auf Endothelzellen.
Introduction
Fluidscherspannung wurde gezeigt , dass endotheliale Genprogramme 1 modulieren – 5 durch Aktivierung von cis-regulatorischen Elemente 6, Histon – Acetyltransferase – Aktivität 7 und Schubspannungsantwortelemente (SSRE) 8. Stress beeinflusst endotheliale Beiträge zur Koagulation durch Modulation Gewebefaktor 9 und Gewebe – Plasminogen – Aktivator (tPA) 10 – Expression scheren. Schubspannung beeinflusst auch die Kontrolle der Angiogenese 11 und Gefäßumbau durch Regulierung PDGF-B – Synthese und Reaktions 8. Die endotheliale abgeleitetes vasoaktiven Mediatoren Adrenomedullin, Endothelin-1, Urotensin II und Relaxin werden auch durch Scherung 12 geregelt. Die Transkription von endothelialen Stickstoffmonoxid-Synthase Produktion und die Produktion von Stickoxid sind beide Scher abhängig 10. Scher steuert auch endothelial ICAM-1 – Expression 13. Strömungsinduzierten Scherspannung kann daher powerfully beeinflussen eine Vielzahl von endothelialen Antworten. Wichtig ist , dass jetzt vaskulären Pulsationen auch eine wichtige Rolle in der Pathophysiologie von sowohl normalen vaskulären Alterungs- und Formen von vaskulärer Demenz 14 und kann sogar dazu beitragen, anderen neurodegenerativen Erkrankungen, wie Multipler Sklerose 15 spielen scheinen.
Venöse und arterielle endotheliale Zellen sind inhärent auf diverse hämodynamischen Strömungsmuster in vivo ausgesetzt ist , und viele verschiedene Phänotypen von Endothelzellen kann 16 gezeigt werden. In Abhängigkeit von der Größe und der Periodizität der Strömungs kann Wirkungen auf Endothelzellen umfassen Entzündungszellaktivierung und die Apoptose, die 17,18 Veränderungen in der Gen oder Protein – Expression widerspiegeln. Untersuchungen an endotheliale Zellantworten Phänomene abzuscheren daher durch die Schwierigkeiten kompliziert bleiben in vitro Modellen in der Herstellung , die ausreichend solchen Schermuster erzeugen.
Viele verschiedene Experimental Protokolle wurden entwickelt Fluidscherbeanspruchung aufzubringen Zellmonolayern an Endothelzellen. Eines der am häufigsten verwendeten Systeme ist der Parallelplattenflusskammer, die innerhalb der Kammer 19 gleichmäßige laminare Strömung erzeugt – 21. Eine peristaltische Pumpe ist typischerweise verbunden periodischen Strömung zu erzeugen, die Eigenschaften Strömungs rekapitulieren kann typischerweise an verschiedenen Orten in vivo 22 gefunden. Ein weiteres gemeinsames Set-up verwendet die "Kegel-Platte" -Modell, in dem Schubspannung durch die Drehzahl des Kegels 23 bestimmt wird. Beide Systeme und andere Anordnungen, die ähnlich zu ihnen kann sehr mühsam sein, einzurichten und Komponenten erfordern, die relativ teuer und unzugänglich für viele Laboratorien sein kann.
Eine andere wesentliche Einschränkung dieser aktuellen Modellen ist die relativ geringe Anzahl an Wiederholungs Studien, die gleichzeitig durchgeführt werden können, die jeweils mit einer relativ geringen Oberfläche. Dies erhöht die Zeit und co mplexity solcher Ansätze. Daher ist es ein ideales Modell, das unidirektionale und periodische Scher induziert könnte sein, wo eine hohe Zahl von Studien Replikaten kann leicht auf, die jeweils mit einer relativ großen Oberfläche eingestellt werden. Darüber hinaus erfordern die oben genannten Modelle eine ziemlich anspruchsvolle Einrichtung, die für viele Anwender unerschwinglich teuer sein kann. Ein Modell, das Fluid-Scher Störungen unter Verwendung von basischen Labormaterialien produzieren kann möglicherweise mehrere Vorteile haben.
Eine einfache und sehr wirtschaftliche Verfahren unidirektional, periodische Scherspannung des Auftragens beinhaltet die Platzierung von kreisförmigen Teller auf einem Kreisschüttler 24. Dieses Protokoll ist sehr einfach und kann bis zu erreichen, eine hohe Zahl von Studie repliziert, die jeweils mit einem relativ großen Oberflächenbereich skaliert werden, wie erforderlich. Jedoch sind in der Mitte der Schale befindlichen Zellen auf unterschiedliche Strömungsmuster als Zellen, die entlang des Umfangs freigelegt, gemischten zellulären phänotypischen Reaktion in der gleichen Schale ergibt.
_content "> In diesem aktuellen Bericht beschreiben wir den Aufbau und die Verwendung von" Scher Ringe ', unser Modell für Stress unidirektional und periodische Scher zu schaffen. Der Entwurf für den Scherring effektiv Grenzen "gemischten" zellulären Phänotypen schub induziert durch die Strömung zu beschränken Weg innerhalb einer Kreiskulturschale an die Peripherie durch die Platzierung eines inneren Rings. der Aufbau und der Betrieb des Scherring ist einfach und wirtschaftlich und kann leicht eine breite Palette von Kreisschüttler aufzunehmen skaliert werden weit verbreitet Gewebekulturversorgungen. Diese Modell kann in Endothelzellen Experimente angewendet werden unidirektional und periodische Strömungsmuster innerhalb der physiologischen und pathophysiologischen Niveaus zur Verfügung zu stellen.Protocol
Representative Results
Discussion
Der Aufbau des Systems Scherring zum Belichten Endothelzellen abzuscheren ist ein einfacher Ansatz Scherspannung Studien durchführen. Dennoch gibt es einige Schritte, die für den Erhalt der überlegenen Scherringe und bessere Ergebnisse kritisch sind. Eine vollständige Abdichtung sollte zwischen dem inneren und dem äußeren Ring zu verhindern Medien aus undichten gemacht werden, die im Widerspruch Scherspannung zwischen den Proben schaffen könnte. Wenn eine vollständige Abdichtung nicht durchgeführt wird, sollte …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten die Hilfe von Herrn Christopher Nguyen, Aaron Hunter und der Shreveport Jumpstart, SMART und Biostart Trainingsprogramme sowie die Centenary College of Louisiana Abteilung für Biophysik, Shreveport, LA anzuerkennen.
Materials
| 100 x 20 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430167 | The dishes must be polystyrene |
| 150 x 25 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430599 | The dishes must be polystyrene |
| 150 mm glass petri dish | Fisher | 3160150BO | |
| 15ml polystyrene tissue culture plastic tubes | Falcon | 352099 | |
| Methylene chloride | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| silicone rubber sealant | DAP | 7079808641 | |
| ethanol | Decon | 2701 | |
| 3 mL transfer pipette | Becton-Dickinson | 357524 | |
| printer paper | |||
| scissors | |||
| gloves | |||
| rotary tool and set | Dremel | 4000-6/50 | |
| rotary tool cutting head | Dremel | EZ476 | |
| rotary tool drill head | |||
| distilled water | |||
| orbital shaker | VWR | 57018-754 | |
| incubator | |||
| Rat retinal microvascular endothelial cells | Cell Biologics | RA-6065 |
References
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