האסיפה והיישום של 'טבעות Shear': מודל האנדותל חדשני Orbital, חד-כיוונית תקופתית נוזלי זרימת מתח שאר
Summary
Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of ‘shear rings’: a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.
Abstract
סטיות רמות ודפוסים נורמלי של תפקידים חשובים לשחק גזירה נוזל וסקולרית בפיזיולוגיה וסקולרית והפתופיזיולוגיה ידי גרימת אדפטיבית וכן שינויים פתולוגיים פנוטיפ האנדותל ביטוי גנים. בפרט, תופעות הסתגלותי של מאמץ גזירה תקופתי, חד כיוון זרימה מושרה יכולות להפעיל מגוון של השפעות על תאי מסווגים מספר כלי דם, במיוחד בתאי האנדותל. בעוד ידי חברה תא אנדותל ממוצאים אנטומיים מגוונים היווה תרבותי, ניתוחים מעמיקים של תגובותיהם גזירה נוזלת כבר הקשו על ידי המורכבות היחסית של מודלי גזירה (למשל, תא זרימת צלחת במקביל, חרוט מודל תזרים צלחת). בעוד אלה מייצגים גישות מעולות, מודלים כאלה הם מסובכים מבחינה טכנית סובלים חסרונות כוללים זמן הכנה ממושך יחסית ומורכב, שטח פנים נמוך, דרישות עבור משאבות לחץ קבוע אשר לעתים קרובות דורשות איטום אטמים, יצירת אתגרים בוטתחזוקת h של עקרות וחוסר יכולת לנהל ניסויים מרובים. עם זאת, אם תימצא בה דמויות תפוקה גבוהות יותר של זרימת גזירה היו זמינות, יותר התקדמות על תגובות גזירה האנדותל של כלי דם, במיוחד מחקר גזירה תקופתי ברמה המולקולרית, עשוי להיות מתקדם במהירות רבה יותר. כאן, אנו מתארים את הבנייה ושימוש טבעות גזירה: רומן, פשוט להרכיב, ודגם בתרבית רקמה זול עם שטח פנים גדול יחסית המאפשר בקלות עבור מספר גבוה של משכפל ניסיוני חד כיווני, מחקרי מתח תקופתי גזירה על תאי האנדותל.
Introduction
מאמץ גזירה נוזל הוכח לווסת תוכניות גן אנדותל 1 – 5 באמצעות הפעלת אלמנטים ציס-רגולטוריות פעילות acetyltransferase 6, היסטון 7 ואלמנטי תגובת לחץ גזירה (SSRE) 8. גזירת שפעות לחץ תרומות אנדותל כלפי קרישה על ידי ויסות רקמות גורם 9 ו activator plasminogen רקמות (tPA) ביטוי 10. גזירת לחץ משפיע גם שליטת אנגיוגנזה 11 שיפוץ כלי ידי ויסות סינתזת PDGF-B והיענות 8. אנדותל, שנגזרה adrenomedullin מתווכים vasoactive, אנדותלין -1, urotensin השנייה relaxin מוסדרים גם על ידי 12 גזירה. תמלול של ייצור synthase תחמוצת חנקן אנדותל ייצור תחמוצת חנקן הם 10 תלויות הגזירה. שאר שולט גם ביטוי ICAM-1 האנדותל 13. מאמץ גזירה נגרם זרימה יכול ולכן powerfully להשפיע מגוון רחב של תגובות האנדותל. חשוב לציין, פעימות לב וכלי דם עכשיו מופיעות גם למלא תפקידים חשובים בפתופיזיולוגיה של שני הזדקנות כלי הדם הנורמלית וצורות של דמנציה וסקולרית 14 ואף עלולה לתרום מחלות ניווניות אחרות, כגון טרשת נפוצה 15.
ורידים ותאי האנדותל עורקים נחשפים מטבעו תבניות זרימה המודינמי מגוונות in vivo, ורבי פנוטיפים תאים שונים אנדותל ניתן הציגו 16. בהתאם לעכל את גודלן ואת המחזוריות של זרימה, השפעות על תאי האנדותל עשויות לכלול הפעלת תא דלקתית אפופטוזיס, אשר עשוי לשקף שינויים בביטוי גנים או חלבון 17,18. מחקרים על תגובות תא האנדותל גזירת תופעות ולכן נשארים מסתבכים בשל הקשיים בהפקה במודלים חוץ גופייה כי כראוי לייצר דפוסי גזירה כזו.
experime רב ושונהפרוטוקולים פתיחות opening סגירות closures פותחו כדי להחיל מאמץ הגזירה נוזל אנדותל monolayers התא. אחת מהמערכות הנפוצות ביותר הוא תא זרימת צלחת במקביל, יוצרת זרימה למינרית אחידה בתוך התא 19 – 21. משאבת peristaltic מחוברת בדרך כלל ליצור זרימה תקופתית, אשר יכול לשחזר מאפייני תזרים נמצאים בדרך כלל במקומות רבים in vivo 22. עוד הגדרת משותף משתמשת במודל 'חרוט צלחת ", שבו מתח גזירה נוזל נקבע על ידי מהירות הסיבוב של החרוט 23. שני מערכות, והסדרים אחרים הדומים להם, יכולים להיות מייגעות להגדיר דורשים רכיבים שיכולים להיות יקר יחסית ולא נגיש למעבדות רבות.
מגבלה עיקרית נוספת של המודלים הנוכחיים אלה הוא מספר נמוך יחסית של מחקרים לשכפל שניתן לבצע בו זמנית, כל אחד עם שטח פנים נמוך יחסית. זו מאריכה את הזמן ושיתוף mplexity של גישות כאלה. לכן, מודל אידיאלי שגורם גזירה חד כיווני ותקופתית עשוי להיות אחד שבו מספר גבוה של משכפל מחקר ניתן להגדיר בקלות, כל אחד עם שטח פנים גדול יחסית. יתר על כן, המודלים הנ"ל דורשים התקנה מתוחכמת למדי, אשר עשוי להיות עלות אוסרני עבור משתמשים רבים. מודל שיכול לייצר הפרעות גזירת נוזל תוך שימוש בחומרי מעבדה בסיסיים עשוי להיות מספר יתרונות.
שיטה פשוטה מאוד חסכונית של החלת מתח גזירה חד כיווני, תקופתי כרוכה את המיקום של מנות חוזרות על שייקר מסלולית 24. פרוטוקול זה הוא פשוט מאוד וניתן לשנותם עד כדי להשיג מספרים גבוהים של מחקר משכפל, כל אחד עם שטח פנים גדול יחסית, בהתאם לצורך. עם זאת, תאים ממוקמים במרכז של המנה נחשפים דפוסי זרימה שונים מאשר תאים לאורך בפריפריה, מניב תגובות פנוטיפי הסלולר מעורבות באותה הצלחת.
_content "> בדו"ח הנוכחי, אנו מתארים את הבנייה והשימוש 'טבעות גזירה', המודל שלנו ליצירת מתח גזירה חד כיווני ותקופתיים. העיצוב של טבעת גזירה פנוטיפים הנגרמת גזירה הסלולר'מעורבים' גבולות באופן יעיל על ידי הגבלת זרימת מסלול בתוך צלחת תרבות עגולה לפריפריה באמצעות המיקום של טבעת פנימית. הקמה וההפעלה של הטבעת הגזירה הוא פשוט וחסכוני, וניתן לשנותם בקלות להכיל מגוון רחב של שייקר מסלולית משימוש בחומרים מתכלים בתרבית רקמה נפוצה. זה מודל יכול להיות מיושם בניסויי תא האנדותל לספק תבניות זרימה חד כיווני ותקופתיות בתוך הרמות פיסיולוגיות pathophysiological.Protocol
Representative Results
Discussion
בניית מערכת הטבעות הגזירה על חשיפת תאי אנדותל גזירה היא גישה פשוטה לביצוע מחקרי מאמץ גזירה. אף על פי כן, ישנם מספר צעדים אשר הם קריטיים עבור קבלת טבעות גזירה מעולות תוצאות טובות יותר. חותם שלם צריך להיעשות בין הטבעת הפנימית וחיצונית כדי למנוע מחומרים מ דולף אשר יכול ל?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות בסיוע מר כריסטופר נגוין, אהרון האנטר Shreveport Jumpstart, SMART, ותוכניות הכשרה Biostart וכן מאה שנה מכללת לואיזיאנה המחלקה לביופיזיקה, Shreveport, LA.
Materials
| 100 x 20 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430167 | The dishes must be polystyrene |
| 150 x 25 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430599 | The dishes must be polystyrene |
| 150 mm glass petri dish | Fisher | 3160150BO | |
| 15ml polystyrene tissue culture plastic tubes | Falcon | 352099 | |
| Methylene chloride | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| silicone rubber sealant | DAP | 7079808641 | |
| ethanol | Decon | 2701 | |
| 3 mL transfer pipette | Becton-Dickinson | 357524 | |
| printer paper | |||
| scissors | |||
| gloves | |||
| rotary tool and set | Dremel | 4000-6/50 | |
| rotary tool cutting head | Dremel | EZ476 | |
| rotary tool drill head | |||
| distilled water | |||
| orbital shaker | VWR | 57018-754 | |
| incubator | |||
| Rat retinal microvascular endothelial cells | Cell Biologics | RA-6065 |
References
- Resnick, N., Gimbrone, M. A. Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression. FASEB J. 9 (10), 874-882 (1995).
- Malek, A. M., Izumo, S. Control of endothelial cell gene expression by flow. J Biomech. 28 (12), 1515-1528 (1995).
- Ando, J., Kamiya, A. Flow-dependent Regulation of Gene Expression in Vascular Endothelial Cells. Jpn Heart J. 37 (1), 19-32 (1996).
- Resnick, N., Yahav, H., et al. Endothelial Gene Regulation by Laminar Shear Stress. Adv Exp Med Biol. 430, 155-164 (1997).
- Gaucher, C., et al. In vitro impact of physiological shear stress on endothelial cells gene expression profile. Clin Hemorheol Mico. 37 (1-2), 99-107 (2007).
- Fisslthaler, B., et al. Identification of a cis -Element Regulating Transcriptional Activity in Response to Fluid Shear Stress in Bovine Aortic Endothelial Cells. Endothelium-J Endoth. 10 (4-5), 267-275 (2003).
- Chen, W., Bacanamwo, M., Harrison, D. G. Activation of p300 Histone Acetyltransferase Activity Is an Early Endothelial Response to Laminar Shear Stress and Is Essential for Stimulation of Endothelial Nitric-oxide Synthase mRNA Transcription. J Biol Chem. 283 (24), 16293-16298 (2008).
- Sumpio, B. E., et al. Regulation of PDGF-B in Endothelial Cells Exposed to Cyclic Strain. Arterioscl Throm Vas. 18 (3), 349-355 (1998).
- Yang, Y., et al. Triplex-forming oligonucleotide inhibits the expression of tissue factor gene in endothelial cells induced by the blood flow shear stress in rats. Acta Pharm Sinic. 41 (9), 808-813 (2006).
- Sumpio, B. E., Chang, R., Xu, W. -. J., Wang, X. -. J., Du, W. Regulation of tPA in endothelial cells exposed to cyclic strain: role of CRE, AP-2, and SSRE binding sites. Am J Physiol. 273 (5 Pt 1), C1441-C1448 (1997).
- Silberman, M., et al. Shear stress-induced transcriptional regulation via hybrid promoters as a potential tool for promoting angiogenesis. Nato Adv Sci Inst Se. 12 (3), 231-242 (2009).
- Dschietzig, T., et al. Flow-induced pressure differentially regulates endothelin-1, urotensin II, adrenomedullin, and relaxin in pulmonary vascular endothelium. Biochem Biophys Res Commun. 289 (1), 245-251 (2001).
- Nagel, T., Resnick, N., Atkinson, W. J., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Shear stress selectively upregulates intercellular adhesion molecule-1 expression in cultured human vascular endothelial cells. J Clin Invest. 94 (2), 885-891 (1994).
- Bateman, G. A., Levi, C. R., Schofield, P., Wang, Y., Lovett, E. C. The venous manifestations of pulse wave encephalopathy: windkessel dysfunction in normal aging and senile dementia. Neuroradiology. 50 (6), 491-497 (2008).
- Juurlink, B. H. J. Is there a pulse wave encephalopathy component to multiple sclerosis. Curr Neurovasc Res. 12 (2), 199-209 (2015).
- Topper, J. N., Gimbrone, M. A. Blood flow and vascular gene expression: fluid shear stress as a modulator of endothelial phenotype. Mol Med Today. 5 (1), 40-46 (1999).
- Tzima, E., et al. A mechanosensory complex that mediates the endothelial cell response to fluid shear stress. Nature. 437 (7057), 426-431 (2005).
- Li, Y. -. S. J., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J Biomech. 38 (10), 1949-1971 (2005).
- Reinhart-King, C. A., Fujiwara, K., Berk, B. C. Physiologic Stress-Mediated Signaling in the Endothelium. Method Enzymol. 443, 25-44 (2008).
- Frangos, J. A., McIntire, L. V., Eskin, S. G. Shear stress induced stimulation of mammalian cell metabolism. Biotechnol Bioeng. 32 (8), 1053-1060 (1988).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress. J Vis Exp. (59), (2012).
- Reinitz, A., DeStefano, J., Ye, M., Wong, A. D., Searson, P. C. Human brain microvascular endothelial cells resist elongation due to shear stress. Microvasc Res. 99, 8-18 (2015).
- Dewey, C. F., Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A., Davies, P. F. The Dynamic Response of Vascular Endothelial Cells to Fluid Shear Stress. J Biomed Eng. 103 (3), 177 (1981).
- Dardik, A., et al. Differential effects of orbital and laminar shear stress on endothelial cells. J Vasc Surg. 41 (5), 869-880 (2005).
- Honda, S., et al. Ligand-induced adhesion to activated endothelium and to vascular cell adhesion molecule-1 in lymphocytes transfected with the N-formyl peptide receptor. J Immunol. 152 (8), 4026-4035 (1994).
- Watt, S. M., Gschmeissner, S. E., Bates, P. A. PECAM-1: its expression and function as a cell adhesion molecule on hemopoietic and endothelial cells. Leukemia Lymphoma. 17 (3-4), 229-244 (1995).
- Fujiwara, K. Platelet endothelial cell adhesion molecule-1 and mechanotransduction in vascular endothelial cells. J Intern Med. 259 (4), 373-380 (2006).
- Dusserre, N. PECAM-1 Interacts With Nitric Oxide Synthase in Human Endothelial Cells: Implication for Flow-Induced Nitric Oxide Synthase Activation. Arterioscl Throm Vas. 24 (10), 1796-1802 (2004).
- Bagi, Z. PECAM-1 Mediates NO-Dependent Dilation of Arterioles to High Temporal Gradients of Shear Stress. Arterioscl Throm Vas. 25 (8), 1590-1595 (2005).
