Forsamlingen og anvendelse av 'Skjær Rings': A Novel endotel modell for Orbital, Enveis og Periodisk Fluid Flow og skjærspenning
Summary
Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of ‘shear rings’: a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.
Abstract
Avvik fra normale nivåer og mønstre for vaskulære væskeskjær spille viktige roller i vaskulær fysiologi og patofysiologi ved å fremkalle adaptiv samt patologiske forandringer i endothelial fenotype og genuttrykk. Spesielt kan mistilpasset virkningene av periodiske, ensrettet strømningsinduserte skyvspenningen utløse en rekke virkninger på flere vaskulære celletyper, særlig endotelceller. Mens nå endotelceller fra ulike anatomiske opprinnelse har vært dyrket, med inngående analyser av deres svar på væske skjær har vært hemmet av den relative kompleksiteten av skjær modeller (f.eks parallell plate flyt kammer, kjegle og plate flytmodell). Mens alle disse representerer gode tilnærminger, slike modeller er teknisk komplisert og lider av ulempene inkludert relativt langvarig og komplisert oppsett tid, lav overflateområder, krav til pumper og trykksetting ofte krever tetningsmidler og pakninger, noe som skaper utfordringer for both vedlikehold av sterilitet og en manglende evne til å kjøre flere eksperimenter. Men hvis høyere gjennomstrømning modeller av flyt og skjær var tilgjengelig, større fremgang på vaskulære endotelceller skjær reaksjoner, spesielt periodisk skjær forskning på molekylært nivå, kan være raskere avansert. Her beskriver vi bygging og bruk av skjærringer: en roman, enkel å montere, og rimelig vev kultur modell med en relativt stor overflate som enkelt gjør det mulig for et høyt antall eksperimentelle replikater i ensrettede, periodisk skjærspenning studier på endotelceller.
Introduction
Fluid skjærspenning har vist seg å modulere endotel-genet programmer 1 – 5 gjennom aktivering av cis-regulatoriske elementene 6, histon acetyltransferase aktiviteten 7 og skjærspenninger responselementer (SSRE) 8. Skjærspenning påvirker endotelial bidrag til koagulering ved å modulere vevsfaktor 9 og vevsplasminogenaktivator (tPA) 10 ekspresjon. Skjærspenning påvirker også kontroll av angiogenese 11 og fartøy ombygging ved å regulere PDGF-B syntese og reaksjonsevne 8. Den endothelial avledet vasoaktive mediatorer adrenomedullin, endotelin-1, urotensin II og relaxin er også regulert av skjær 12. Transkripsjonen av endotel nitrogenoksid syntase produksjon og nitrogenoksydproduksjon er begge skjæravhengig 10. Skjær styrer også endothelial ICAM-1 uttrykk 13. Flow-indusert skjærspenning kan derfor powerfully påvirker et stort utvalg av endotel-responser. Viktigere, vaskulære impulser nå også synes å spille en viktig rolle i patofysiologien av både normal vaskulær aldring og former av vaskulær demens 14 og kan til og med bidra til andre nevrodegenerative sykdommer, for eksempel multippel sklerose 15.
Venøse og arterielle endoteliale celler er naturlig utsatt for diverse hemodynamiske strømningsmønstre in vivo, og mange forskjellige endotelcelle fenotyper kan bli utstilt 16. Avhengig av størrelsen og periodisitet av strømning, kan virkninger på endotelceller inkluderer inflammatorisk celleaktivering og apoptose, noe som kan gjenspeile endringer i genet eller proteinekspresjon 17,18. Studier på endothelial celle responser for å klippe fenomener derfor forblir komplisert av vanskelighetene i å produsere in vitro modeller som i tilstrekkelig grad produserer slike skjær mønstre.
Mange forskjellige experimental protokoller har blitt utviklet for å søke væske skjærspenning til endotelceller monolagene. En av de mest vanlig anvendte systemer er den parallelle platen strømningskammeret, noe som skaper ensartet laminær strømning i kammeret 19-21. En peristaltisk pumpe er typisk forbundet til å lage periodisk strømning, noe som kan rekapitulere strømningskarakteristika som vanligvis finnes på mange steder in vivo 22. En annen vanlig oppsett anvender den "kjegle og plate 'modell, hvor fluidskjærspenning er bestemt av rotasjonshastigheten av kjeglen 23. Begge systemene, og andre ordninger som ligner på dem, kan være kjedelig å sette opp og krever komponenter som kan være relativt dyrt og utilgjengelig for mange laboratorier.
En annen vesentlig begrensning av disse nåværende modeller er det forholdsvis lave antall gjentatte undersøkelser som kan utføres samtidig, hver med et relativt lavt overflateareal. Dette øker tiden og co mplexity av slike tilnærminger. Derfor kan en ideell modell som induserer ensrettet og periodisk skjær være en hvor et høyt antall studie gjentak kan enkelt settes opp, hver med en relativt stor overflate. Videre er de ovenfor nevnte modeller krever en relativt sofistikert oppsett, som kan være kostnads prohibitive for mange brukere. En modell som kan produsere fluidskjær forstyrrelser ved bruk av basiske laboratorium materialer kan ha flere fordeler.
En enkel og meget økonomisk fremgangsmåte for å påføre ensrettet, periodisk skjærbelastning innebærer plassering av sirkulære retter på en orbital-rystemaskin 24. Denne protokollen er svært enkel og kan bli skalert opp for å oppnå et høyt antall replikater studium, hver med et forholdsvis stort overflateareal, etter behov. Imidlertid er celler lokalisert i sentrum av skålen utsettes for ulike strømningsmønstre enn celler langs periferien, hvilket ga blandede cellulære fenotypiske responser i det samme fatet.
_content "> I denne aktuelle rapporten beskriver vi bygging og bruk av 'skjærringer', vår modell for å skape enveis og periodisk skjærspenning. Utformingen for skjærring effektivt begrenser 'blandet' cellulære skjær-indusert fenotyper ved å begrense strømmen sti innenfor en sirkulær kultur rett til periferien gjennom plassering av en indre ring. bygging og drift av skjærring er enkel og økonomisk og kan enkelt skaleres for å imøtekomme et bredt spekter av orbital shakers bruker allment tilgjengelig vev kultur forsyninger. Denne modellen kan brukes i endotel-celleforsøk for å tilveiebringe ensrettede og periodiske strømningsmønster innenfor fysiologiske og patofysiologiske nivåer.Protocol
Representative Results
Discussion
Konstruksjonen av skjærringen system for å utsette endotelceller til å skjære seg er en enkel metode for å utføre skjærspenning studier. Likevel er det noen få trinn som er kritisk for å oppnå overlegen skjærringer og bedre resultater. En fullstendig tetning bør gjøres mellom den indre og ytre ring for å hindre at mediet fra å lekke noe som kan skape inkonsekvent skjærspenning mellom prøvene. Hvis en fullstendig tetning ikke er fremstilt, bør en minimal mengde metylenklorid tilsettes til kanten mellom …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke hjelp av Mr. Christopher Nguyen, Aaron Hunter og Shreveport Jumpstart, SMART, og Biostart opplæringsprogrammer samt Centenary College of Louisiana avdeling for biofysikk, Shreveport, LA.
Materials
| 100 x 20 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430167 | The dishes must be polystyrene |
| 150 x 25 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430599 | The dishes must be polystyrene |
| 150 mm glass petri dish | Fisher | 3160150BO | |
| 15ml polystyrene tissue culture plastic tubes | Falcon | 352099 | |
| Methylene chloride | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| silicone rubber sealant | DAP | 7079808641 | |
| ethanol | Decon | 2701 | |
| 3 mL transfer pipette | Becton-Dickinson | 357524 | |
| printer paper | |||
| scissors | |||
| gloves | |||
| rotary tool and set | Dremel | 4000-6/50 | |
| rotary tool cutting head | Dremel | EZ476 | |
| rotary tool drill head | |||
| distilled water | |||
| orbital shaker | VWR | 57018-754 | |
| incubator | |||
| Rat retinal microvascular endothelial cells | Cell Biologics | RA-6065 |
References
- Resnick, N., Gimbrone, M. A. Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression. FASEB J. 9 (10), 874-882 (1995).
- Malek, A. M., Izumo, S. Control of endothelial cell gene expression by flow. J Biomech. 28 (12), 1515-1528 (1995).
- Ando, J., Kamiya, A. Flow-dependent Regulation of Gene Expression in Vascular Endothelial Cells. Jpn Heart J. 37 (1), 19-32 (1996).
- Resnick, N., Yahav, H., et al. Endothelial Gene Regulation by Laminar Shear Stress. Adv Exp Med Biol. 430, 155-164 (1997).
- Gaucher, C., et al. In vitro impact of physiological shear stress on endothelial cells gene expression profile. Clin Hemorheol Mico. 37 (1-2), 99-107 (2007).
- Fisslthaler, B., et al. Identification of a cis -Element Regulating Transcriptional Activity in Response to Fluid Shear Stress in Bovine Aortic Endothelial Cells. Endothelium-J Endoth. 10 (4-5), 267-275 (2003).
- Chen, W., Bacanamwo, M., Harrison, D. G. Activation of p300 Histone Acetyltransferase Activity Is an Early Endothelial Response to Laminar Shear Stress and Is Essential for Stimulation of Endothelial Nitric-oxide Synthase mRNA Transcription. J Biol Chem. 283 (24), 16293-16298 (2008).
- Sumpio, B. E., et al. Regulation of PDGF-B in Endothelial Cells Exposed to Cyclic Strain. Arterioscl Throm Vas. 18 (3), 349-355 (1998).
- Yang, Y., et al. Triplex-forming oligonucleotide inhibits the expression of tissue factor gene in endothelial cells induced by the blood flow shear stress in rats. Acta Pharm Sinic. 41 (9), 808-813 (2006).
- Sumpio, B. E., Chang, R., Xu, W. -. J., Wang, X. -. J., Du, W. Regulation of tPA in endothelial cells exposed to cyclic strain: role of CRE, AP-2, and SSRE binding sites. Am J Physiol. 273 (5 Pt 1), C1441-C1448 (1997).
- Silberman, M., et al. Shear stress-induced transcriptional regulation via hybrid promoters as a potential tool for promoting angiogenesis. Nato Adv Sci Inst Se. 12 (3), 231-242 (2009).
- Dschietzig, T., et al. Flow-induced pressure differentially regulates endothelin-1, urotensin II, adrenomedullin, and relaxin in pulmonary vascular endothelium. Biochem Biophys Res Commun. 289 (1), 245-251 (2001).
- Nagel, T., Resnick, N., Atkinson, W. J., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Shear stress selectively upregulates intercellular adhesion molecule-1 expression in cultured human vascular endothelial cells. J Clin Invest. 94 (2), 885-891 (1994).
- Bateman, G. A., Levi, C. R., Schofield, P., Wang, Y., Lovett, E. C. The venous manifestations of pulse wave encephalopathy: windkessel dysfunction in normal aging and senile dementia. Neuroradiology. 50 (6), 491-497 (2008).
- Juurlink, B. H. J. Is there a pulse wave encephalopathy component to multiple sclerosis. Curr Neurovasc Res. 12 (2), 199-209 (2015).
- Topper, J. N., Gimbrone, M. A. Blood flow and vascular gene expression: fluid shear stress as a modulator of endothelial phenotype. Mol Med Today. 5 (1), 40-46 (1999).
- Tzima, E., et al. A mechanosensory complex that mediates the endothelial cell response to fluid shear stress. Nature. 437 (7057), 426-431 (2005).
- Li, Y. -. S. J., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J Biomech. 38 (10), 1949-1971 (2005).
- Reinhart-King, C. A., Fujiwara, K., Berk, B. C. Physiologic Stress-Mediated Signaling in the Endothelium. Method Enzymol. 443, 25-44 (2008).
- Frangos, J. A., McIntire, L. V., Eskin, S. G. Shear stress induced stimulation of mammalian cell metabolism. Biotechnol Bioeng. 32 (8), 1053-1060 (1988).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress. J Vis Exp. (59), (2012).
- Reinitz, A., DeStefano, J., Ye, M., Wong, A. D., Searson, P. C. Human brain microvascular endothelial cells resist elongation due to shear stress. Microvasc Res. 99, 8-18 (2015).
- Dewey, C. F., Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A., Davies, P. F. The Dynamic Response of Vascular Endothelial Cells to Fluid Shear Stress. J Biomed Eng. 103 (3), 177 (1981).
- Dardik, A., et al. Differential effects of orbital and laminar shear stress on endothelial cells. J Vasc Surg. 41 (5), 869-880 (2005).
- Honda, S., et al. Ligand-induced adhesion to activated endothelium and to vascular cell adhesion molecule-1 in lymphocytes transfected with the N-formyl peptide receptor. J Immunol. 152 (8), 4026-4035 (1994).
- Watt, S. M., Gschmeissner, S. E., Bates, P. A. PECAM-1: its expression and function as a cell adhesion molecule on hemopoietic and endothelial cells. Leukemia Lymphoma. 17 (3-4), 229-244 (1995).
- Fujiwara, K. Platelet endothelial cell adhesion molecule-1 and mechanotransduction in vascular endothelial cells. J Intern Med. 259 (4), 373-380 (2006).
- Dusserre, N. PECAM-1 Interacts With Nitric Oxide Synthase in Human Endothelial Cells: Implication for Flow-Induced Nitric Oxide Synthase Activation. Arterioscl Throm Vas. 24 (10), 1796-1802 (2004).
- Bagi, Z. PECAM-1 Mediates NO-Dependent Dilation of Arterioles to High Temporal Gradients of Shear Stress. Arterioscl Throm Vas. 25 (8), 1590-1595 (2005).
