La Asamblea y la Aplicación de 'Shear Anillos': A Novel endotelial Modelo de Orbital, unidireccional y periódica flujo de fluido y la tensión de cizallamiento
Summary
Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of ‘shear rings’: a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.
Abstract
Las desviaciones de los niveles normales y los patrones de juego de cizallamiento importantes funciones de fluido vascular en la fisiología vascular y la fisiopatología de la inducción de adaptación, así como los cambios patológicos en el fenotipo endotelial y la expresión génica. En particular, los efectos de mala adaptación de, la tensión de cizallamiento inducido por el flujo unidireccional periódica puede accionar una variedad de efectos sobre varios tipos de células vasculares, en particular células endoteliales. Mientras que por ahora las células endoteliales de diversos orígenes anatómicos han sido cultivadas, los análisis en profundidad de sus respuestas a la fricción fluida se han visto obstaculizados por la relativa complejidad de los modelos de corte (por ejemplo, la cámara de flujo de placas paralelas, cono y placa de modelo de flujo). Si bien todos estos representan excelentes enfoques, tales modelos son técnicamente complicado y adolecen de inconvenientes, incluyendo el tiempo de preparación relativamente largo y complejo, las zonas superficiales bajas, los requisitos para las bombas de presurización y con frecuencia requieren sellantes y juntas, creando retos para both mantenimiento de la esterilidad y una incapacidad para ejecutar múltiples experimentos. Sin embargo, si estaban disponibles, mayor progreso en las respuestas cortantes endoteliales vasculares mayores modelos de rendimiento de flujo y corte, la investigación de cizallamiento sobre todo periódica a nivel molecular, podría ser más avanzado rápidamente. A continuación, se describe la construcción y el uso de anillos de corte: una novela, sencilla de montar, y el modelo de cultivo de tejidos de bajo costo con una superficie relativamente grande que permite fácilmente de un alto número de réplicas experimentales en, cizalla periódica estudios de estrés unidireccionales en células endoteliales.
Introduction
Tensión de cizallamiento de fluido se ha demostrado que modulan programas de genes endoteliales 1-5 través de la activación de los elementos reguladores cis-6, la actividad histona acetiltransferasa 7 y elementos de respuesta a la tensión de cizallamiento (SSRE) 8. Cizallamiento influencias de estrés contribuciones endoteliales hacia la coagulación mediante la modulación del factor tisular 9 y activador del plasminógeno tisular (tPA) 10 expresión. Esfuerzo de corte también influye en el control de la angiogénesis 11 y el remodelado vascular mediante la regulación de la síntesis de PDGF-B y la capacidad de respuesta 8. El derivado del endotelio mediadores vasoactivos adrenomedulina, la endotelina-1, urotensina II y relaxina también están regulados por cizallamiento 12. La transcripción de la producción de óxido nítrico sintasa endotelial y la producción de óxido nítrico son ambos dependientes de cizallamiento 10. Shear también controla endoteliales ICAM-1 de expresión 13. Flujo inducido por esfuerzo de corte, por tanto, puede powerfuinfluir LLY una gran variedad de respuestas endoteliales. Es importante destacar que, pulsaciones vasculares ahora también parecen jugar un papel importante en la fisiopatología de tanto el envejecimiento vascular normal y formas de demencia vascular 14 y pueden incluso contribuir a otras enfermedades neurodegenerativas, tales como la esclerosis múltiple 15.
Venosa y las células endoteliales arteriales son inherentemente expuestos a diversos patrones de flujo hemodinámicos in vivo, y muchos diferentes fenotipos de células endoteliales pueden ser exhibidos 16. Dependiendo de la magnitud y la periodicidad de flujo, los efectos sobre las células endoteliales pueden incluir la activación de células inflamatorias y la apoptosis, lo que puede reflejar los cambios en el gen o proteína de expresión 17,18. Los estudios sobre las respuestas de células endoteliales a cizalla fenómenos por lo tanto permanecen complicados por las dificultades en la producción de modelos in vitro que producen adecuadamente tales patrones de corte.
Muchos EXPERIME diferenteprotocolos NTAL se han desarrollado para aplicar la tensión de cizallamiento de fluido a monocapas de células endoteliales. Uno de los sistemas más utilizados es la cámara de flujo de placas paralelas, lo que crea un flujo laminar uniforme dentro de la cámara 19 – 21. Una bomba peristáltica suele estar conectado para crear un flujo periódico, que pueden recapitular las características de flujo que se encuentran típicamente en muchos lugares en vivo 22. Otra forma común de configuración utiliza el modelo de 'cono y placa', donde el estrés de cizalla de fluidos está determinada por la velocidad de rotación del cono 23. Ambos sistemas, y otros arreglos similares a ellos, puede ser tedioso de instalar y requieren componentes que pueden ser relativamente caro e inaccesible para muchos laboratorios.
Otra limitación importante de estos modelos actuales es el número relativamente bajo de los estudios de replicación que se pueden realizar de forma simultánea, cada uno con un área de superficie relativamente baja. Esto aumenta el tiempo y co mplexity de tales enfoques. Por lo tanto, un modelo ideal que induce la cizalladura unidireccional y periódica podría ser uno donde un alto número de repeticiones de estudio se puede configurar fácilmente, cada uno con una superficie relativamente grande. Además, los modelos anteriormente mencionados requieren una configuración bastante sofisticado, que puede ser un costo prohibitivo para muchos usuarios. Un modelo que puede producir alteraciones de cizalla de fluidos utilizando materiales básicos de laboratorio puede tener varias ventajas.
Un método simple y muy económica de la aplicación de la tensión de cizallamiento unidireccional, periódica consiste en la colocación de platos circulares en un agitador orbital 24. Este protocolo es muy simple y se puede escalar hasta alcanzar altos números de estudio réplicas, cada uno con un área superficial relativamente grande, según sea necesario. Sin embargo, las células situadas en el centro del plato están expuestos a diferentes patrones de flujo de las células a lo largo de la periferia, dando respuestas fenotípicas celulares mixtos en el mismo plato.
_content "> En este informe, se describe la construcción y el uso de 'anillos de corte', nuestro modelo para la creación de tensión de corte unidireccional y periódica. El diseño para el anillo de corte efectiva fenotipos de cizalla inducida por celulares 'mixtos' Limita al restringir el flujo vía dentro de una placa de cultivo circular a la periferia a través de la colocación de un anillo interior. la construcción y el funcionamiento del anillo de corte es simple y económico y se puede escalar fácilmente para acomodar una amplia gama de agitadores orbitales usando suministros de cultivo de tejidos ampliamente disponibles. Esta modelo puede ser aplicado en los experimentos de células endoteliales para proporcionar patrones de flujo unidireccional y periódicos dentro de los niveles fisiológicos y fisiopatológicos.Protocol
Representative Results
Discussion
La construcción del sistema de anillo de corte para la exposición de células endoteliales a la cizalla es un método simple para la realización de estudios de estrés de cizallamiento. Sin embargo, hay algunos pasos que son críticos para la obtención de los anillos de corte superiores y mejores resultados. Un sello completo debe hacerse entre el anillo interior y exterior para evitar que el material de filtración que podría crear tensión de corte varía entre las distintas muestras. Si un sello completo no se h…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer la asistencia del Sr. Christopher Nguyen, Aaron Hunter y el enlace personalizado Shreveport, SMART, y programas de formación biostart, así como el departamento de Centenary College of Louisiana de Biofísica, Shreveport, LA.
Materials
| 100 x 20 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430167 | The dishes must be polystyrene |
| 150 x 25 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430599 | The dishes must be polystyrene |
| 150 mm glass petri dish | Fisher | 3160150BO | |
| 15ml polystyrene tissue culture plastic tubes | Falcon | 352099 | |
| Methylene chloride | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| silicone rubber sealant | DAP | 7079808641 | |
| ethanol | Decon | 2701 | |
| 3 mL transfer pipette | Becton-Dickinson | 357524 | |
| printer paper | |||
| scissors | |||
| gloves | |||
| rotary tool and set | Dremel | 4000-6/50 | |
| rotary tool cutting head | Dremel | EZ476 | |
| rotary tool drill head | |||
| distilled water | |||
| orbital shaker | VWR | 57018-754 | |
| incubator | |||
| Rat retinal microvascular endothelial cells | Cell Biologics | RA-6065 |
References
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