Анизотропию, как флуоресценция инструмента для изучения белок-белковых взаимодействий

Summary

Белковых взаимодействий в основе функции клетки. Калориметрические и спектроскопические методы широко используются для их характеристики. Здесь мы опишем флуоресцентной анизотропии в качестве инструмента для изучения взаимодействия между белком мутировал в синдром Shwachman-DIAMOND (SBDS) и фактор элонгации типа 1 GTPase (EFL1).

Abstract

Белок-белковые взаимодействия играют существенную роль в функционировании живого организма. После того, как взаимодействие было определено и подтверждено, необходимо охарактеризовать его на структурном и механистической уровне. Существует несколько биохимических и биофизических методов для этой цели. Среди них, анизотропии флуоресценции мощный метод особенно используется, когда интенсивность флуоресценции флуорофора-меченого белка остается постоянным при белок-белкового взаимодействия. В этой технике, флуорофор-меченого белка возбуждается с вертикально-поляризованным светом с соответствующей длиной волны, который селективно возбуждают подмножество флуорофоров в соответствии с их относительной ориентации с помощью входящего пучка. В результате эмиссии также имеет направленность, отношения которых в вертикальной и горизонтальной плоскостях определяет анизотропии (г) следующим образом : г = (I _VV -I _В.Х.) / (I _VV + 2I _В.Х.), где я _VV , и я <sUB> В.Х. являются интенсивности флуоресценции вертикальной и горизонтальной компонент, соответственно. Флуоресцентная анизотропия чувствительна к вращательной диффузии флуорофор, а именно кажущегося размера молекул флуорофора, присоединенного к белку, который при измененном белок-белкового взаимодействия. В настоящем тексте, использование анизотропии флуоресценции в качестве инструмента для изучения белок-белковых взаимодействий был примером для решения связывания между белком мутировавшего при синдроме Shwachman-DIAMOND (SBDS) и фактор элонгации, как-1 GTPase (EFL1). Обычно маркировка белка с флуорофором осуществляется на тиоловые группы (цистеин) или в группах, амино (N-концевыми аминогруппами или лизин) белка. Тем не менее, SBDS обладает несколькими цистеина и лизинов, которые не позволяли сайт направленного маркировки его. В качестве альтернативного метода, краситель 4 ', 5'-бис (1,3,2-dithioarsolan 2-ил) флуоресцеина использовался для специально маркировать tetracysteine ​​мотив, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, методами генной инженерии в С-конце рекомбинантного белка SBDS. Место экспериментальных данных при условии количественного и механистической информации о связывании режиме между этими белками.

Introduction

Клетки содержат множество биомакромолекулах, которые постоянно взаимодействуют друг с другом. Эта ассоциация рождает комплексы, которые участвуют в клеточных путей, ответственных за их функционирование в сигнальной трансдукции, регуляции экспрессии генов и миграции клеток среди других. Все белок-белковых взаимодействий, которые происходят в клетке составляют сеть, известную как интерактома. В Saccharomyces CEREVISIAE было показано более чем 70% от его белков , чтобы иметь взаимодействующих партнеров ^1. Понимание интерактома клетки и их функции предоставляют соответствующую информацию о сложности и разнообразии живых организмов. Несколько методик были описаны для идентификации и характеристики белок-белковых взаимодействий. Различные высоко через положить методы , такие как дрожжи дигибридная ^2, белок-фрагмент комплементационных анализов ^{3, 4} аффинной очистки в сочетании с масс – спектрометрии и белка microarraYS используются для идентификации взаимодействия ^5,6. После идентификации, необходимо проверить его, и это может варьироваться в зависимости от случая к случаю. Как правило, эти эксперименты связаны с срыве самого взаимодействия на уровне отдельных членов пары взаимодействия, например, путем делеции гена или избыточная экспрессия одного из белков, а затем ищет изменения в свойствах или функции другого члена в то на клеточном уровне. Впоследствии, биофизические методы ⁷ используются для характеристики белок-белковых взаимодействий на молекулярном уровне. С этой целью, структура белковых комплексов определяются с помощью рентгеновской кристаллографии, ядерного магнитного резонанса и крио-электронной микроскопии в то время как калориметрии и флуоресцентной спектроскопии используются для количественной и механистически описания.

В этой работе, анизотропии флуоресценции использовали в качестве методики для характеристики взаимодействия между ГТФ EFL1 и SBDS белок. Эти белки участвуют в синтезе рибосом путем содействия высвобождение эукариотических фактора инициации 6 от поверхности 60S рибосомальной субъединицей ^8. Белок SBDS мутирует в заболевание , известное как Shwachman-Даймонд синдром ⁹ и действует как фактор обмена гуанина нуклеотиддля EFL1 уменьшая его сродство к гуанозиндифосфат ^10,11. мутации болезни в SBDS отменить взаимодействие с EFL1 и тем самым предотвратить его активацию.

Флуоресцентная анизотропия обычно используется в биологических приложениях для изучения белок-пептид или взаимодействий белок-нуклеиновых кислот. Он основан на принципе, что флуорофор возбуждаемых с поляризованными светом приводит частично поляризованного излучения. Анизотропии флуоресценции определяется уравнением 1:

где я _VV , и я _В.Х. являютсяинтенсивности флуоресценции вертикально _(VV) и по горизонтали _(VH) поляризован излучение , когда образец возбуждается с вертикально поляризованный свет ^12. Флуоресцентная анизотропия чувствительна к факторам, которые влияют на скорость вращательной диффузии флуорофора и, таким образом, зависит от температуры, вязкости раствора и кажущегося размера молекул флуорофора. Видимый размер белка, содержащего флуорофор увеличивается, когда он взаимодействует с другим белком, и такое изменение может быть оценена как изменение анизотропии. Более конкретно, флуорофор , который вращается медленно в растворе по отношению к его жизни флуоресцентного будет иметь большое значение , я _VV и малое значение I _{V H} , и , следовательно , будет демонстрировать относительно большую анизотропию. Для флуорофоров , что ОБРУШЬТЕСЬ быстро по сравнению с их флуоресцентным жизни, я _VV , и я _В.Х. будут подобны и их анизотропии значение будет небольшим ¹² </sup> (Рисунок 1). Кроме того, для хорошей анизотропии сигнал измерения уровня шума, необходимо иметь флуорофор с времени жизни флуоресценции, подобной времени вращательной корреляции интерес молекулы. В противном случае, не представляется возможным точно регистрировать разницу в анизотропии между свободным белком и что в комплексе. Например, анизотропия флуоресцентного зонда с временем жизни около 4 наносекунд, такие как флуоресцеин или родамин, прикрепленных к низкомолекулярного соединения молекулярного 100 дальтон составляет 0,05. Связывание с молекулой 160 кДа увеличит его анизотропии значение 0,29; различие, которое может быть точно измерена. В противоположность этому, тот же флуоресцентного зонда участвуют в реакции связывания, чей рост размера молекул варьируется от 65 до 1000 кДа, приведет лишь к изменению анизотропии 0,28 до 0,3, который слишком мал, чтобы быть точно измерена. В этом случае зонд со временем жизни 400 нсек был бы более подходящим ^12.

<pкласс = "jove_content">
Рисунок 1. Схематическое изображение оборудования , используемого для измерения анизотропии флуоресценции и процедуры. Схематическое изображение оборудования , используемого для выполнения измерительный белок-белок эксперимент взаимодействия анизотропии флуоресценции. Флуорофоры , что барабанные быстрый дисплей небольшой анизотропии , которая увеличивает на связывание с партнером взаимодействия. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Флуоресцентные системы требуют присутствия флуорофор в любой из молекул изученных. Для изучения белок-белковых взаимодействий, существуют три типа флуорофоров: 1) Триптофан остатки, присутствующие в белках, 2) химически присоединенные флуорофоры и 3) флюоресцентные партнеры слитые, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP) и его Derivaставители. Большинство белков имеют остатки триптофана на его структуру, таким образом, самый простой способ измерить взаимодействие является путем мониторинга изменений в соответствующих спектров флуоресценции или путем наблюдения за изменениями в интенсивности флуоресценции остатков триптофана. Тем не менее, триптофан остатки могут присутствовать в обоих белках, усложняющих анализ. С другой стороны, для флуорофора, чтобы изменить его флуоресцентные свойства из-за взаимодействия он должен быть расположен на или вблизи сайта связывания, и это может помешать само взаимодействие. Это требует особого внимания при использовании громоздких флуорофоры, такие как GFP. Если ни один из этих флуорофоров не может быть использован для исследований связывания необходимо, а затем, чтобы ввести примесные флуорофоры к одному из белков, участвующих. Многие химически синтезированные флуорофоры существовать и могут быть ковалентно связаны с белками через их реакционноспособные группы, такие как аминные группы (боковой цепи лизина или N-конца) и тиоловых групп в цистеин. Fпроизводные luorophore с изотиоцианатных и сукцинимидиловых эфиры реагируют с амидной группы в то время как йодацетамида и малеимидная являются тиол-реактивные группы ^13. Наиболее распространенные красители, используемые в приложениях флуоресцентных являются производными флуоресцеина и родамина зеленые красители, кумарины, BODIPY флуорофоры и Alexa Fluor красители. Подробный перечень коммерчески доступных флуорофоров и их использование можно найти в ссылках ^14,15. Для успешной маркировки, реактивная группа должна быть открыта на поверхности белка, но из-за большого количества химически активных функциональных групп, обычно присутствующих в полипептидах очень трудно получить модификации конкретного участка. Белок интерес в данном исследовании, SBDS, содержит 5 свободных цистеина и 33 лизинов, которые могут привести к многократной маркировки сайта. Неравномерный маркировка может повлиять на связывании и усложнит анализ данных, как разные молекулы флуорофором могут вызывать различные сигналы интенсивности флуоресценции при связывании. Для Овеrcome эту проблему, мы использовали флуорофора âñïûøêè, 4 ', 5'-бис (1,3,2 dithioarsolan-2-ил) флуоресцеина сайт-прямой этикетке белок SBDS. Это arsenoxide краситель с высоким сродством к четырем разнесенных цистеина в мотиве знают , как ФЛЭШ-тег , состоящий из CCXXCC последовательности , где X обозначает любую аминокислоту, кроме цистеина ^16,17. Этот tetracysteine ​​мотив добавлен к N- или С-конце белка методом генной инженерии вместе с соответствующим линкером для предотвращения нарушения общей складки белка. Пара , состоящая из красителя и ФЛЭШ ФЛЭШ-таг был первоначально разработан для сайт-специфических белков меток в живых клетках ¹⁷ , но он также может быть использован для обозначения очищенных белков в пробирке , как это иллюстрируется здесь. Кроме того, ферментативные стратегии были также разработаны для того, чтобы сайт-специфической функционализации белков ^18.

В этой рукописи мы опишем полезность флуоресцентной анизотропии аса инструмент для изучения белок-белковых взаимодействий. Связывание может быть оценена с помощью простого осмотра связывающей формы кривой в то время как количественная информация может быть получена из подгонки экспериментальных данных.

Protocol

1. SBDS-ФЛЭШ Tag Экспрессия белка и очистка Примечание: Для экспериментов анизотропии, фотовспышка-тег, соответствующий последовательности Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys был добавлен к С-концу человеческого SBDS кодирующей последовательности с помощью ПЦР. Эту конструкцию субклонируют в вектор экспресс?…

Representative Results

Для выполнения любой анизотропии эксперимент, важно, чтобы исключить большие изменения в интенсивности флуоресценции флуорофора, так как наблюдаемая анизотропия смеси вида представлен уравнением 5: <img alt="Equation5" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq5.jpg"…

Discussion

Большинство биохимических экспериментов с белками требуют не только чистый белок, но и большое количество них, независимо от используемого метода. По этой причине белки, используемые для этого типа экспериментов получаются гетерогенной экспрессии, как это было в случае, представленн?…

Materials

0.5 mm Glass beads	Biospec Products	11079105
Tris Base	Formedium	TRIS01	Ultra pure
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
dye 4’, 5’-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein	ThermoFischer Scientific	LC6090	This kit contains the dye to label a FlAsH tag
Ampiciline	IBI Shelton Scientific, Inc	IB02040
D(+)-Glucose Anhydrous	Formedium	GLU03
D(+)-Galactose	Formedium	GAL03
L-Leucine	Formedium	DOC0157
L-Tryptofan	Formedium	DOC0189
Bezamidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	B6506-5G
PMSF	Gold Biotechnology, Inc	P-470-25	Phenylmethylsulfonyl fluoride
NaCl	Formedium	NAC02	Sodium Chloride
Glycerol	Tecsiquim, S.A. de C.V.	GT1980-6
MgCl2	Merck Millipore Corporation	1725711000	Magnesium Chloride
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399-500G
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P3786-500G	Potassium phosphate dibasic
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S3139-500G	Sodium phosphate monobasic
Yeast nitrogen base without amino acids	Formedium	CYN0410
Yeast extract	Formedium	YEM03	Micro Granulated
L-Tyroisne	Formedium	DOC0193
Adenine sulphate	Formedium	DOC0230
Casamino acids	Formedium	CAS03
Tryptone	IBI Shelton Scientific, Inc	IB49182
IPTG	Formedium	IPTG025
Name of Material	Company	Catalog Number	Comments/Description
Filtration units	Merck Millipore Corporation	UFC901096	Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10 kDa
Membrane Filter	Merck Millipore Corporation	GSWP04700	Membrane Filter, mixed cellulose esters, Hydrophilic, 0.22 µm, 47 mm, white, plain
Ni2+ affinity column	QIAGEN	30760	Cartridge pre-filled with 5 ml Ni-NTA Superflow
Strong Sulfopropyl cation exchanger column	GE Healthcare Life Science	17-5157-01	HiTrap SP Sepharose FF 5 ml
Size Exclusion column	GE Healthcare Life Science	28989335	HiLoad 16/600 Superdex 200 PG
Fluorescence cell	Hellma Analytics	111-057-40
Name of Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Spectrophotometer	Agilent Technologies	G6860AA	Cary 60 UV-Vis
Shaker	ThermoFischer Scientific	SHKA4000-7	MaxQ 4000 Benchtop temperature range Ambient-15° to 60°C
Centrifuge	ThermoFischer Scientific	75004271	Heraeus Megafuge 16R
FPLC	Pharmacia Biotech	Discontinued	FPLC system conductivity UV-MM II monitor P500 pump fraction
Spectrofluorometer	Olis	No applicable	Olis DM 45 with Polarization Toolbox