المتقدم نموذج حيواني من القولون والمستقيم ورم خبيث في الكبد: تقنيات التصوير وخصائص النقيلي النسخ
Summary
The ability of metastatic clones to colonize distant sites depends on their proliferation capacity and/or their ability to survive in the host microenvironment without significant proliferation. Here, we present an animal model that allows quantitative visualization of both types of liver colonization by metastatic clones.
Abstract
المرضى الذين يعانون من عدد محدود من النقائل الكبدية وبطء معدلات التقدم يمكن علاجها بنجاح مع العلاج المحلية النهج 1،2. ومع ذلك، لا يعرف إلا القليل عن عدم تجانس الانبثاث الكبد، وهناك حاجة إلى نماذج حيوانية قادرة على تقييم وضع المستعمرات النقيلي الفردية. هنا، نقدم نموذجا متقدما النقائل الكبدية التي توفر القدرة على تصور كمي لتطوير استنساخ ورم الفردية في الكبد وتقدير حركية النمو والكفاءة الاستعمار. ولدت لنا لوحة من المشتقات وحيدة النسيلة من HCT116 خلايا سرطان القولون البشري المسمى مستقر مع وسيفيراز وtdTomato وحيازة خصائص النمو المختلفة. مع حقن الطحال يتبعه استئصال الطحال، ومعظم هذه الحيوانات المستنسخة قادرة على توليد الانبثاث الكبد، ولكن مع ترددات مختلفة من الاستعمار ومتفاوتة معدلات النمو. باستخدام الانظمه في فيفو التصويرم (IVIS)، فمن الممكن تصور وقياس تطور ورم خبيث في الجسم الحي مع الانارة وخارج الجسم الحي التصوير الفلورسنت. وبالإضافة إلى ذلك، منتشر الفلورسنت التصوير المقطعي (DLIT) يوفر التوزيع 3D الانبثاث الكبد في الجسم الحي. فيفو السابقين التصوير الفلورسنت من كبد تحصد يوفر القياسات الكمية للفرد المستعمرات النقيلي الكبد، مما يسمح لتقييم وتيرة الاستيطان الكبد وحركية النمو الانبثاث. منذ نموذج مشابه لالانبثاث الكبد لوحظ سريريا، يمكن أن تكون بمثابة طريقة للكشف عن الجينات المرتبطة ورم خبيث في الكبد ولاختبار علاجات الجر أو مادة مساعدة المحتملة لمرض النقيلي الكبد.
Introduction
وتتميز المرضى الذين يعانون من الانبثاث الكبد من سرطان القولون الأولية (CRC) من المضاعفات الخطيرة. معدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات الأولية nonmetastatic اتفاقية حقوق الطفل (المرحلتين الأولى – III) ويقدر أن 75 – 88٪ 3،4، في حين أن المرضى الذين يعانون من الانبثاث الكبد (المرحلة الرابعة) لديها معدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات فقط 8-12٪ 5 (6). ومع ذلك، والمرضى المنتشر تمثل مجموعة غير متجانسة، مع تقديم أرقام مختلفة من الانبثاث ومرات تكرار مختلفة. وتشير الملاحظات السريرية أن عدد الانبثاث (التي قد تكون متناسبة مع استعمار القدرة أو تردد من الاستعمار) وحجم أي ورم خبيث واحد (النسبي لمعدل النمو المحلي) عوامل النذير مستقلة 1،7. وبعبارة أخرى، فإن نجاح استنساخ النقيلي استعمار الكبد يعتمد على خاصيتين رئيسية هي: قدرتها على النمو وقدرتها على نشر والبقاء على قيد الحياة في المكروية الكبد.
التصميمنماذج سريرية ناجحة مع القدرة على التقاط وقياس خصائص الحيوانات المستنسخة المنتشر يمكن أن تحسن بشكل كبير من فهمنا للكبد البيولوجيا ورم خبيث وتوفير أداة فعالة لتصميم مناهج علاجية محتملة. وقد ذكرت نماذج من ورم خبيث في الكبد التجريبية سابقا 8،9، ولكن أيا منهما قدم القدرة على التقاط كميا ووصف خصائص الحيوانات المستنسخة النقيلي الفردية على حد سواء في الجسم الحي وخارج الحي.
هنا، نقدم نموذج جديد متطور من ورم خبيث في الكبد الذي يتضمن جيل من الحيوانات المستنسخة ورم مع مختلف الكفاءات الاستعمار الكبد وخصائص النمو. قمنا بتوظيف مجموعة من ثنائي العلامات على الخلايا السرطانية مع وسيفيراز وtdTomato بروتين فلوري مع جيل من خطوط الخلايا وحيدة النسيلة التي لديها اختلافات جوهرية في قدرة النقيلي. في هذا النموذج التجريبي، وتشير البيانات إلى أن تطويريمكن وصف الانبثاث الكبد من حيث التردد الاستعمار ومضاعفة الوقت (الدفتيريا)، وهو ما يتسق مع الملاحظات السريرية. طبيعة الكمية من هذا النموذج يجعل من تبنيهم بسهولة لاكتشاف الأدوية وأغراض التشخيص.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويستند نموذج حيواني الواردة في التقرير الحالي على منهجين رئيسيين. أولا، من أجل ضمان القدرة على مراقبة الحيوانات المستنسخة النقيلي مع النزعات المختلفة للاستعمار وتتكاثر في الكبد، تأسست لجنة من خطوط الخلايا وحيدة النسيلة غير متجانسة إلى حد كبير، بدلا من خط الخلايا ا?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر الدكتور جيفري L. غرين (جامعة شيكاغو) لالبلازميد Luc2-tdTomato وخط الخلية HCT116، السيد العاني سولانكي (مركز الثروة الحيوانية) للإدارة الفئران، والدكتور لارا ليوني للمساعدة مع DLIT. أجريت التحديد الكمي لشدة الفلورسنت والانارة في الحيوانات الصغيرة التصوير الموارد البحثية المتكاملة في جامعة شيكاغو على الطيف IVIS (PERKINELMER، هوبكينتون، MA). وأيد هذا العمل من قبل ولاية فرجينيا وصندوق لودفيغ DK لأبحاث السرطان ومؤسسة الرئة أبحاث السرطان (LCRF)، ومؤسسة سرطان البروستاتا (PCF)، وسرطان مركز دعم جرانت (P30CA014599). كان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر، أو في الإعداد للمخطوطة.
Materials
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Caliper Life Sciences | 124262 | In vivo imaging system |
| LivingImage 4.0 Software | Caliper Life Sciences | 128165 | Imaging software |
| VAD-MGX Research Anesthetic Machine | Vetamac | VAD-MGX | Inhalation anesthesia machine |
| DMEM | Gibco | 11965-118 | Cell culture reagents |
| DPBS | Gibco | 14190250 | Cell culture reagents |
| Penicillin-Streptomycin, liquid (10,000 units penicillin;10,000 μg streptomycin) | Invitrogen | 15140163 | Cell culture reagents |
| HBSS | ThermoFisher | 24020117 | Cell culture reagents |
| Buprenex Injection (0.3mg/mL) | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | 12496-0757-5 | Buprenorphine hydrochloride |
| Gemini Cautery System | Braintree Scientific | GEM 5917 | Hand-held cautery for splenectomy |
| Micro Clip; Straight; 70 Grams Pressure; 1.5mm Clip Width; 10mm Jaw Length | Roboz Surgical Instrument | RS-5426 | Hemoclip: Hemostasis instruments after spleen injection |
| D-luciferin, potassium salt | Goldbio Technology | LUCK-1G | Luciferin potassium salt |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985062 | Reduced Serum Medium |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450102 | Automatic cell counter |
| JMP10 software | SAS Institute | Data analysis software | |
| BD FACSAria II cell sorter | BD Biocsiences | Cell sorter |
References
- Fong, Y., Fortner, J., Sun, R. L., Brennan, M. F., Blumgart, L. H. Clinical score for predicting recurrence after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: analysis of 1001 consecutive cases. Ann. Surg. 230 (3), 309-318 (1999).
- Pawlik, T. M., et al. Effect of surgical margin status on survival and site of recurrence after hepatic resection for colorectal metastases. Ann. Surg. 241 (5), 715-722 (2005).
- Park, J. H., Watt, D. G., Roxburgh, C. S., Horgan, P. G., McMillan, D. C. Colorectal Cancer, Systemic Inflammation, and Outcome: Staging the Tumor and Staging the Host. Ann. Surg. 263 (2), 326-336 (2016).
- Veen, T., et al. Long-Term Follow-Up and Survivorship After Completing Systematic Surveillance in Stage I-III Colorectal Cancer: Who Is Still at Risk. J. Gastrointest. Cancer. 46 (3), 259-266 (2015).
- Siegel, R., et al. Cancer treatment and survivorship statistics. CA Cancer J. Clin. 62 (2), 220-241 (2012).
- O’Connell, J. B., Maggard, M. A., Ko, C. Y. Colon cancer survival rates with the new American Joint Committee on Cancer sixth edition staging. J. Natl. Cancer Inst. 96 (19), 1420-1425 (2004).
- House, M. G., et al. Survival after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: trends in outcomes for 1,600 patients during two decades at a single institution. J. Am. Coll. Surg. 210 (5), 744-752 (2010).
- Smakman, N., Martens, A., Kranenburg, O., Borel Rinkes, I. H. Validation of bioluminescence imaging of colorectal liver metastases in the mouse. J. Surg. Res. 122 (2), 225-230 (2004).
- Rajendran, S., et al. Murine bioluminescent hepatic tumour model. J. Vis. Exp. (41), (2010).
- Oshima, G., et al. Imaging of tumor clones with differential liver colonization. Sci. Rep. 5 (10946), (2015).
- Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
- Wang, X. M., et al. Integrative analyses identify osteopontin, LAMB3 and ITGB1 as critical pro-metastatic genes for lung cancer. PLoS One. 8 (2), e55714 (2013).
- Fidler, I. J., Kripke, M. L. Metastasis results from preexisting variant cells within a malignant tumor. Science. 197 (4306), 893-895 (1977).
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Khodarev, N. N., et al. STAT1 pathway mediates amplification of metastatic potential and resistance to therapy. PLoS One. 4 (6), e5821 (2009).
- Langley, R. R., Fidler, I. J. Tumor cell-organ microenvironment interactions in the pathogenesis of cancer metastasis. Endocr. Rev. 28 (3), 297-321 (2007).
- Lussier, Y. A., et al. Oligo- and polymetastatic progression in lung metastasis(es) patients is associated with specific microRNAs. PLoS One. 7 (12), e50141 (2012).
- Lussier, Y. A., et al. MicroRNA expression characterizes oligometastasis(es). PLoS One. 6 (12), e28650 (2011).
- Calon, A., et al. Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation. Cancer Cell. 22 (5), 571-584 (2012).
- Vanharanta, S., Massague, J. Origins of metastatic traits. Cancer Cell. 24 (4), 410-421 (2013).
- Khodarev, N. N., Roizman, B., Weichselbaum, R. R. Molecular pathways: Interferon/Stat1 Pathway: Role in the tumor resistance to genotoxic stress and aggressive growth. Clin. Cancer Res. 18 (11), 3015-3021 (2012).
- Li, C., et al. Interferon-stimulated gene 15 (ISG15) is a trigger for tumorigenesis and metastasis of hepatocellular carcinoma. Oncotarget. 5 (18), 8429-8441 (2014).
- Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. Am. J. Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).
- Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J. Vis. Exp. (10), (2007).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J. Vis. Exp. (27), e51677 (2014).
- Evans, J. P., et al. From mice to men: Murine models of colorectal cancer for use in translational research. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 98, 94-105 (2016).
