Geavanceerde diermodel van colorectale metastase in de lever: Imaging technieken en eigenschappen van gemetastaseerde Clones
Summary
The ability of metastatic clones to colonize distant sites depends on their proliferation capacity and/or their ability to survive in the host microenvironment without significant proliferation. Here, we present an animal model that allows quantitative visualization of both types of liver colonization by metastatic clones.
Abstract
Patiënten met een beperkt aantal levermetastasen en langzame snelheden van progressie succes kan worden behandeld met lokale behandeling benaderingen 1,2. Er is echter weinig bekend over de heterogeniteit van levermetastasen en diermodellen staat zijn de ontwikkeling van afzonderlijke metastatische kolonies nodig. Hier presenteren we een geavanceerd model van levermetastasen dat het vermogen om kwantitatief visualiseren de ontwikkeling van individuele klonen tumor in de lever en schatten hun groeikinetiek en kolonisatie efficiëntie wordt bereikt. We genereerden een paneel van monoklonale derivaten van HCT116 humane colorectale kankercellen stabiel gelabeld met luciferase en tdTomato en die verschillende groei-eigenschappen. Met een milt injectie, gevolgd door een splenectomie, de meerderheid van deze klonen kunnen levermetastasen genereren, maar met verschillende frequenties kolonisatie en variërende groei. Met behulp van de in vivo beeldvorming System (IVIS), is het mogelijk te visualiseren en kwantificeren metastase ontwikkeling van in vivo en ex vivo luminescerende fluorescente beeldvorming. Bovendien Diffuse Luminescent Imaging Tomography (DLIT) een 3D verdeling van levermetastasen in vivo. Ex vivo fluorescentie beeldvorming van geoogste levers levert kwantitatieve metingen van afzonderlijke hepatische metastatische kolonies, waardoor de evaluatie van de frequentie van de lever kolonisatie en groeikinetiek van uitzaaiingen. Omdat het model lijkt op klinisch waargenomen levermetastasen, kan het dienen als een modaliteit voor het detecteren van genen geassocieerd met levermetastasen en voor het testen van potentiële ablatieve of adjuvante therapieën voor lever metastasen.
Introduction
Patiënten met levermetastasen van primaire colorectale kanker (CRC) worden gekenmerkt door een slechte prognose. De 5-jaarsoverleving voor de primaire nonmetastatic CRC (stadium I – III) wordt geschat op 75-88% 3,4, terwijl patiënten met leveruitzaaiingen (fase IV) hebben een 5-jaarsoverleving van slechts 8 – 12% 5 , 6. Echter, metastatische patiënten vormen een heterogene groep, die zich presenteren met verschillende aantallen metastasen en verschillende herhaling tijden. Klinische waarnemingen geven aan dat het aantal metastasen en de grootte van een enkele metastase (evenredig aan de plaatselijke groeisnelheid) (die evenredig koloniserend vermogen of de frequentie van kolonisatie kan zijn) onafhankelijke prognostische factoren 1,7. Met andere woorden, het succes van klonen metastatische kolonisatie van de lever is afhankelijk van twee belangrijke eigenschappen: ze kunnen groeien en hun vermogen om te verspreiden en te overleven in de lever micromilieu.
Het ontwerpsuccesvolle klinische modellen met de mogelijkheid van het vastleggen en kwantificeren van de eigenschappen van metastatische klonen drastisch ons begrip van levermetastasen biologie verbeteren en een effectief hulpmiddel voor het ontwerpen van mogelijke therapeutische benaderingen. Modellen van experimentele levermetastasen zijn eerder gerapporteerd 8,9, maar geen van beide ontvangen het vermogen om kwantitatief vast te leggen en te beschrijven eigenschappen van afzonderlijke uitgezaaide klonen zowel in vivo als ex vivo.
Hier presenteren we een nieuwe geavanceerde model van levermetastasen dat de vorming van tumor klonen met verschillende efficiënties lever kolonisatie en groei eigenschappen omvat. We gebruikten een combinatie van dubbele-labeling van kankercellen met luciferase en tdTomato fluorescerend eiwit met de productie van monoklonale cellijnen die intrinsieke verschillen in metastatische capaciteit. In dit experimentele model, de gegevens blijkt dat de ontwikkeling vanlevermetastasen kan worden beschreven in termen van frequentie en kolonisatie verdubbelingstijd (Td), wat overeenkomt met klinische waarnemingen. De kwantitatieve karakter van dit model maakt het gemakkelijk adoptable voor de ontdekking van geneesmiddelen en diagnostische doeleinden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het dier model voorgesteld in het huidige rapport is gebaseerd op twee belangrijke benaderingen. Ten eerste, om het vermogen om metastatische klonen met verschillende neigingen waarnemen te koloniseren en prolifereren in de lever te waarborgen, een panel van zeer heterogene monoklonale cellijnen werd vastgesteld ipv een vastgestelde ongefractioneerde kankercellijn 12,13. De monoklonale benadering van metastase ontwikkeling wordt gerechtvaardigd door de recente genomische data 14 en werd met succes …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen graag bedanken Dr. Geoffrey L. Greene (University of Chicago) voor de Luc2-tdTomato plasmide en de HCT116 cellijn, Mr. Ani Solanki (Animal Resource Center) voor de muizen management, en Dr. Lara Leoni voor de hulp de DLIT. Kwantificering van fluorescente en lichtgevende intensiteiten werden uitgevoerd in de Integrated Small Animal Imaging Research Resource aan de Universiteit van Chicago op een IVIS Spectrum (PerkinElmer, Hopkinton, MA). Dit werk werd ondersteund door de Virginia en DK Ludwig Fonds voor Kankeronderzoek, de Lung Cancer Research Foundation (LCRF), de Prostate Cancer Foundation (PCF), en het Cancer Center Ondersteuning Grant (P30CA014599). De financiers hadden geen rol in de onderzoeksopzet, gegevensverzameling en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript.
Materials
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Caliper Life Sciences | 124262 | In vivo imaging system |
| LivingImage 4.0 Software | Caliper Life Sciences | 128165 | Imaging software |
| VAD-MGX Research Anesthetic Machine | Vetamac | VAD-MGX | Inhalation anesthesia machine |
| DMEM | Gibco | 11965-118 | Cell culture reagents |
| DPBS | Gibco | 14190250 | Cell culture reagents |
| Penicillin-Streptomycin, liquid (10,000 units penicillin;10,000 μg streptomycin) | Invitrogen | 15140163 | Cell culture reagents |
| HBSS | ThermoFisher | 24020117 | Cell culture reagents |
| Buprenex Injection (0.3mg/mL) | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | 12496-0757-5 | Buprenorphine hydrochloride |
| Gemini Cautery System | Braintree Scientific | GEM 5917 | Hand-held cautery for splenectomy |
| Micro Clip; Straight; 70 Grams Pressure; 1.5mm Clip Width; 10mm Jaw Length | Roboz Surgical Instrument | RS-5426 | Hemoclip: Hemostasis instruments after spleen injection |
| D-luciferin, potassium salt | Goldbio Technology | LUCK-1G | Luciferin potassium salt |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985062 | Reduced Serum Medium |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450102 | Automatic cell counter |
| JMP10 software | SAS Institute | Data analysis software | |
| BD FACSAria II cell sorter | BD Biocsiences | Cell sorter |
References
- Fong, Y., Fortner, J., Sun, R. L., Brennan, M. F., Blumgart, L. H. Clinical score for predicting recurrence after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: analysis of 1001 consecutive cases. Ann. Surg. 230 (3), 309-318 (1999).
- Pawlik, T. M., et al. Effect of surgical margin status on survival and site of recurrence after hepatic resection for colorectal metastases. Ann. Surg. 241 (5), 715-722 (2005).
- Park, J. H., Watt, D. G., Roxburgh, C. S., Horgan, P. G., McMillan, D. C. Colorectal Cancer, Systemic Inflammation, and Outcome: Staging the Tumor and Staging the Host. Ann. Surg. 263 (2), 326-336 (2016).
- Veen, T., et al. Long-Term Follow-Up and Survivorship After Completing Systematic Surveillance in Stage I-III Colorectal Cancer: Who Is Still at Risk. J. Gastrointest. Cancer. 46 (3), 259-266 (2015).
- Siegel, R., et al. Cancer treatment and survivorship statistics. CA Cancer J. Clin. 62 (2), 220-241 (2012).
- O’Connell, J. B., Maggard, M. A., Ko, C. Y. Colon cancer survival rates with the new American Joint Committee on Cancer sixth edition staging. J. Natl. Cancer Inst. 96 (19), 1420-1425 (2004).
- House, M. G., et al. Survival after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: trends in outcomes for 1,600 patients during two decades at a single institution. J. Am. Coll. Surg. 210 (5), 744-752 (2010).
- Smakman, N., Martens, A., Kranenburg, O., Borel Rinkes, I. H. Validation of bioluminescence imaging of colorectal liver metastases in the mouse. J. Surg. Res. 122 (2), 225-230 (2004).
- Rajendran, S., et al. Murine bioluminescent hepatic tumour model. J. Vis. Exp. (41), (2010).
- Oshima, G., et al. Imaging of tumor clones with differential liver colonization. Sci. Rep. 5 (10946), (2015).
- Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
- Wang, X. M., et al. Integrative analyses identify osteopontin, LAMB3 and ITGB1 as critical pro-metastatic genes for lung cancer. PLoS One. 8 (2), e55714 (2013).
- Fidler, I. J., Kripke, M. L. Metastasis results from preexisting variant cells within a malignant tumor. Science. 197 (4306), 893-895 (1977).
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Khodarev, N. N., et al. STAT1 pathway mediates amplification of metastatic potential and resistance to therapy. PLoS One. 4 (6), e5821 (2009).
- Langley, R. R., Fidler, I. J. Tumor cell-organ microenvironment interactions in the pathogenesis of cancer metastasis. Endocr. Rev. 28 (3), 297-321 (2007).
- Lussier, Y. A., et al. Oligo- and polymetastatic progression in lung metastasis(es) patients is associated with specific microRNAs. PLoS One. 7 (12), e50141 (2012).
- Lussier, Y. A., et al. MicroRNA expression characterizes oligometastasis(es). PLoS One. 6 (12), e28650 (2011).
- Calon, A., et al. Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation. Cancer Cell. 22 (5), 571-584 (2012).
- Vanharanta, S., Massague, J. Origins of metastatic traits. Cancer Cell. 24 (4), 410-421 (2013).
- Khodarev, N. N., Roizman, B., Weichselbaum, R. R. Molecular pathways: Interferon/Stat1 Pathway: Role in the tumor resistance to genotoxic stress and aggressive growth. Clin. Cancer Res. 18 (11), 3015-3021 (2012).
- Li, C., et al. Interferon-stimulated gene 15 (ISG15) is a trigger for tumorigenesis and metastasis of hepatocellular carcinoma. Oncotarget. 5 (18), 8429-8441 (2014).
- Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. Am. J. Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).
- Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J. Vis. Exp. (10), (2007).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J. Vis. Exp. (27), e51677 (2014).
- Evans, J. P., et al. From mice to men: Murine models of colorectal cancer for use in translational research. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 98, 94-105 (2016).
