Fabricage en Drug Delivery Toepassingen van Silk Nanodeeltjes

Summary

Nanodeeltjes zijn in opkomst als veelbelovende dragersystemen voor een groot aantal indicaties. Hier beschrijven we een eenvoudige maar krachtige methode om zijde nanodeeltjes produceren met behulp van reverse engineered Zijdevlinder zijde. Deze zijde nanodeeltjes kunnen gemakkelijk worden geladen met een therapeutische payload en vervolgens verkend voor drug delivery applicaties.

Abstract

Zijde is een veelbelovende biopolymeer voor biomedische en farmaceutische toepassingen vanwege zijn uitstekende mechanische eigenschappen, biologische verenigbaarheid en biologische afbreekbaarheid, en zijn vermogen om te beschermen en vervolgens de lading vrij te geven in reactie op een trigger. Terwijl zijde kan geformuleerd worden in verschillende formaten materiaal zijn zijde nanodeeltjes opkomst als veelbelovende geneesmiddelafgiftesystemen. Daarom dit artikel worden de procedures voor reverse engineering zijdecocons een zijde geregenereerde oplossing die kan worden gebruikt om stabiele zijde nanodeeltjes genereren opleveren. Deze nanodeeltjes worden vervolgens gekarakteriseerd met geneesmiddel beladen en onderzocht als potentiële antikanker geneesmiddelafgiftesysteem. In het kort worden zijdecocons omgekeerde eerst ontwikkeld door ontgommen de cocons, gevolgd door zijde ontbinding en schoon te maken, om een ​​waterige zijde oplossing opleveren. Vervolgens wordt de geregenereerde oplossing zijde onderworpen aan nanoprecipitation aan zijde nanodeeltjes verkregen – een eenvoudige maar krachtige methodedat genereert uniforme nanodeeltjes. De zijden nanodeeltjes worden gekenmerkt volgens hun grootte, zèta-potentiaal, morfologie en stabiliteit in waterige media, evenals hun vermogen om een ​​chemotherapeutisch payload vangen en doden van menselijke borstkankercellen. Kortom, de beschreven werkwijze levert uniform zijde nanodeeltjes die gemakkelijk kunnen worden onderzocht voor een groot aantal toepassingen, waaronder het gebruik als potentiële nanomedicine.

Introduction

Nanogrootte geneesmiddelafgiftesystemen worden vaak gebruikt om geneesmiddelafgifte te regelen en een diverse reeks therapeutische nuttige lading afgeven – bijvoorbeeld, eiwitten, peptiden en kleine moleculaire gewicht drugs – cellen en weefsels te richten. Deze therapeutische ladingen worden vaak verwerkt in verschillende macromoleculaire dragers voor geneesmiddelen, zoals liposomen, in water oplosbare polymeren (inclusief dendrimeren) en micro- en nanodeeltjes ^1. Nanodeeltjes (meestal in een groot bereik van 1 nm tot 1000 nm) worden op grote schaal onderzocht als potentiële dragers voor geneesmiddelen, in het bijzonder voor anti-kanker drug delivery ^2. De succesvolle introductie van Abraxane (120 nm en kleinbedrijf albumine-based nanodeeltjes geladen met paclitaxel) in de dagelijkse klinische praktijk ³ heeft het veld gekatalyseerd, zodat veel meer nanodeeltjes voor drug delivery nu zijn het invoeren van klinische proeven ^4. Solide tumoren algemeen slechte lymfatische drainage en hebben lekkende bloedvaten waardoor nanoparticles tot 200 nm wordt passief worden gericht op deze tumoren na intraveneuze toediening. Deze passieve targeting verschijnsel heet de verhoogde permeabiliteit en retentie (EPR) effect en werd voor het eerst in 1986 ^5. De EPR effect kan leiden tot een 50- tot 100-voudige toename van de geneesmiddelconcentraties in de tumor micro-omgeving voor een gegeven dosis geneesmiddel indien het geneesmiddel lading wordt geleverd met een macromoleculair geneesmiddeldrager benadering dan het vrije geneesmiddel zonder de drager. Met geneesmiddel beladen nanodeeltjes gemaakt van anti-kanker drug delivery moet de tumor micro bereiken en moeten vaak een specifieke intracellulaire compartiment voeren gewoonlijk door endocytische opname voor het geneesmiddel zijn gewenste therapeutische effect te bereiken ^3. Nanodeeltjes ontworpen voor intracellulaire afgifte van geneesmiddelen benutten endocytose als toegangspoort in de cel en een route naar geneesmiddelenresistentie mechanismen overwinnen. Geneesmiddelafgifte uit nanodeeltjes vaak specifiek ontworpen occur in lysosomen (dwz lysosomotrope drug delivery) ^6, waar de pH gevoeligheid van de nanodeeltjes carrier (lysosomale pH ongeveer 4,5) als trigger voor geneesmiddelafgifte of lysosomale enzymen die de lading bevrijden van de drager ⁷ kan dienen.

Veel verschillende soorten materialen kunnen worden gebruikt om nanodeeltjes (bijvoorbeeld metalen en vele organische en anorganische stoffen) te genereren. Echter, biopolymeren opkomst als aantrekkelijke materialen vanwege hun bekende biocompatibiliteit, biologische afbreekbaarheid en lage toxiciteit ^8. Veel biopolymeren worden onderzocht, met inbegrip van albumine, alginaat, chitosan en zijde. Daarvan heeft zijde ontpopt als een veelbelovende kandidaat voor ontwikkeling in drug delivery systemen ^9. Zijde van verschillende soorten worden geproduceerd door een aantal geleedpotigen, zoals spinnen (bijvoorbeeld Nephila clavipes) en zijderupsen (bijvoorbeeld Bombyx mori). Zijderups zijde wordt gebruikt veel meer extensluitend dan spinnenzijde omdat de zijderups is volledig geacclimatiseerd en zijn zijde vormt aldus een reproduceerbaar uitgangsmateriaal. Zijderups zijde is een Food and Drug Administration (FDA) goedgekeurd materiaal voor menselijk gebruik, met name als hechtmateriaal; Het heeft een robuust veiligheidsniveau bij de mens en is bekend te worden afgebroken in vivo ^10. De afbraak profiel van zijde kan worden afgestemd op variëren van uur (laag kristallijn zijde) tot 12 maanden of meer (hoog kristallijne zijde). Zijde afbraakproducten zijn niet giftig en worden gemetaboliseerd in het lichaam ^10. De zijde structuur verleent het vermogen laag molecuulgewicht verbindingen en macromoleculaire eiwitgeneesmiddelen ¹¹ te binden, waardoor het een goed materiaal voor gecontroleerde geneesmiddelafgifte. Eiwitgeneesmiddelen (bijvoorbeeld antilichamen) zijn gevoelig voor denaturatie, aggregatie, proteolytische splitsing en goedkeuring door het immuunsysteem. Echter, zijde stabiliseert therapeutische eiwitten door de buffercapaciteit van de nanokristallijne reregio's en zijn vermogen om watergehalte afstemmen op nanoschaal ^11. Deze unieke functies bieden fysieke bescherming en verminderen payload mobiliteit ¹¹ en zijn meestal niet gezien met andere (bio) polymeren. Veel anti-kanker drug delivery systemen, bijvoorbeeld-zijde gebaseerde hydrogels ^12, films ^13-15 en nanodeeltjes ^16,17, zijn inmiddels ontwikkeld om deze mogelijkheden te benutten (beoordeeld in de referenties ^18,19)

Hier werden zijde nanodeeltjes gekenmerkt door het bepalen van hun grootte en lading over een langere periode. Doxorubicine, een klinisch relevante geneesmiddel tegen kanker, werd gebruikt als een model geneesmiddel voor geneesmiddelbelading en cytotoxiciteit studies triple negatieve humane borstkankercellen behandeld met geneesmiddel beladen nanodeeltjes zijde.

Protocol

1. Bereiding van een reverse engineered Silk Solution van Zijdevlinder cocons LET OP: Deze methode is gebaseerd op protocollen elders 12,27 beschreven. Snijd 5 g gedroogde cocons met een schaar in 5 mm x 5 mm stuks. Verwijder alle vervuilde lagen. Weeg 4,24 g natriumcarbonaat en daarna wordt voorzichtig dit 2 liter kokend gedestilleerd water. Opmerking: Dit levert een 0,02 M natriumcarbonaatoplossing. Voeg de gesneden stukken de cocon kokende natriumcarbo…

Representative Results

De gegevens werden statistisch geanalyseerd zoals eerder 17 beschreven. t-test van de Student's werd gebruikt voor monster paren en one-way variantie-analyse (ANOVA), gevolgd door meervoudige vergelijking Bonferroni's post hoc test voor meerdere monsters. Een sterretje geeft statistische significantie als volgt: * p <0,05 en ** p <0,001. Alle gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) en de getallen tussen haakjes geven het aantal onaf…

Discussion

Verschillende werkwijzen zijn beschikbaar voor zijde nanodeeltjes, zoals polyvinylalcohol mengen ²⁰ produceren, sproeidrogen ^21, uitzouten ^22, capillaire microdot bedrukt ^23, superkritisch _CO2 precipitatie ²⁴ en nanoprecipitation ^16,25 (besproken in referentie ^26). Echter, nanoprecipitation door zijn totale eenvoud, is de meest populaire techniek voor het genereren zijde nanodeeltjes. Daarom is het doel van deze studie was te passen …

Materials

Acetone	VWR International, Radnor, PA, USA	20066.33
Automated Critical Point Dryer	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	EM CPD300
Balancing	Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland	NewClassic MS
Black polystyrene microplate , 96 well	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	3991
Capillary cell (DTS 1070)	Malvern Instrument, Worcestershire, UK	DTS107
Carbon adhesive disc	Agar Scientific, Essex, UK	G3347N
Centrifuge	Hermle Labortechnik, Wehingen, Germany	Z323K
Centrifuge	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	Avanti J-E, Rotor: J20
Centrifuge	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	Optima L-70K, Rotor: 50.2 Ti, Adaptor 303392
Coater, low vacuum	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	EM ACE200
Cuvettes, polystyrene, disposable	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	FB55147
Doxorubixin	LC Laboratories, Boston, MA, USA	D4000
Electronic pipetting, Easypet	Eppendorf, Hamburg, Germany	N/A
FE-SEM	Hitachi High-Technologies, Krefeld, Germany	SU6600
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	16000-044
Freeze dryer	Martin Christ, Osterode, Germany	Epsilon 2-4
Heat inactivated Bombyx mori silk cocoons	Tajima Shoji, Kanagawa, Japan	N/A
Hotplate with Stirrer	Bibby Scientific, Stanffordshire, UK	US 152
Incubator	Memmert, Schwabach, Germany	INB 200
Insulin, human recombinant, zinc solution	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	12585-014
Lithium bromide	Acros Organics, Geel, Belgium	AC199870025
MDA-MB-231	ATCC, Manassas, VA, U.S.A	N/A
Micropipette and tips	Eppendorf, Hamburg, Germany	N/A
Microplate Reader	Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA	SpectraMax M5
Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes, 50 ml	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	N/A
Open-Top Thickwall Polycarbonate tube, 4 ml	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	355645
Penicilin/streptomycin	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	15140-122
RPMI medium	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	11875-093
Serological pipettes, 5 ml	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Silicon wafers	Agar Scientific, Essex, UK	G3391
Slide-A-Lyzer Dialysis cassettes, 3.5K MWCO, 15 ml	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	87724
Sodium carbonate anhydrous	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	S/2840/62
Specimen stubs for SEM	Agar Scientific, Essex, UK	G301
Ultrasonic homogenizer	Bandelin, Berlin, Germany	Sonoplus HD 2070
UV transparent microplate, 96 well	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	3635
Vortex	IKA, Staufen, Germany	Genius 3
Zetasizer	Malvern Instrument, Worcestershire, UK	Nano ZS
Zetasizer Software version 7.11			DLS software
Micro Modulyo	Thermo Fisher	230	Freeze drying system