Produksjon og levering av legemidler Anvendelser av Silk Nanopartikler

Summary

Nanopartikler er fremstår som lovende stoffet leveringssystemer for et bredt spekter av indikasjoner. Her beskriver vi en enkel, men kraftfull metode for å produsere silke nanopartikler ved hjelp av omvendt utvikling silkeorm silke. Disse silke nanopartikler kan lett lastet med en terapeutisk nyttelast og senere utforsket for levering av legemidler programmer.

Abstract

Silke er et lovende biopolymer for biomedisinske og farmasøytiske anvendelser på grunn av sine fremragende mekaniske egenskaper, biokompatibilitet og biologisk nedbrytbarhet, samt dens evne til å beskytte og deretter frigi dens nyttelast som respons på en utløser. Mens silke kan formuleres i forskjellige material formater, er silke nanopartikler fremstår som lovende medikamentavleveringssystemer. Derfor denne artikkelen dekker prosedyrene for reverse engineering silke kokonger for å gi en regenerert silke løsning som kan brukes til å generere stabile silke nanopartikler. Disse nanopartiklene senere blir preget, narkotika lastet og utforsket som en potensiell kreft narkotika leveringssystem. Kort fortalt er silke kokonger reverskonstruert først ved degumming kokonger, etterfulgt av silke oppløsning og rydde opp, for å gi en vandig silke løsning. Deretter blir den regenererte silke løsningen utsatt for nanoprecipitation å gi silke nanopartikler – en enkel, men effektiv metodesom genererer uniform nanopartikler. Silke nanopartikler er karakterisert i henhold til deres størrelse, zeta potensial, morfologi og stabilitet i vandige medier, så vel som deres evne til å fange et kjemoterapeutisk nyttelast og drepe humane brystcancerceller. Samlet sett gir den beskrevne metoden ensartede silke nanopartikler som lett kan utforskes for en myriade av programmer, inkludert deres bruk som en potensiell nanomedisin.

Introduction

Nanostørrelse medikamentleveringssystemer er ofte brukes for å kontrollere medikamentfrigjøring og for å levere et variert sett av terapeutiske nyttelaster – for eksempel, proteiner, peptider og små molekylvekt legemidler – til målceller og vev. Disse terapeutiske nyttelaster blir ofte innlemmet i forskjellige makromolekylære legemiddelbærere, for eksempel liposomer, vannoppløselige polymerer (inkludert dendrimerer), og mikro- og nanopartikler ^1. Nanopartikler (typisk i et størrelsesområde fra 1 nm til 1000 nm) blir mye undersøkt som potensielle legemiddelbærere, spesielt for antikreftlegemiddelavlevering ^2. Den vellykkede introduksjonen av Abraxane (120 nm store albumin-baserte nanopartikler lastet med paclitaxel) i rutinemessig klinisk praksis ^tre har katalysert feltet, slik at mange flere nanopartikler for levering av legemidler går nå inn i kliniske studier ^4. Solide svulster viser generelt dårlig lymfedrenasje og har lekk blodkar som betyr at nanoparticles på opp til 200 nm vil bli passivt rettet mot disse svulstene etter intravenøs administrasjon. Dette passive målretting fenomenet kalles forbedret permeabilitet og retensjon (EPR) virkning, og ble først rapportert i 1986 ^5. EPR-effekten kan føre til en 50- til 100-gangers økning i medikamentkonsentrasjon innen tumoren mikromiljøet for en gitt legemiddeldose når medikamentet nyttelasten blir levert ved hjelp av et makromolekylært medikament bærer tilnærming heller enn fritt medikament uten bæreren. Narkotika lastet nanopartikler laget for kreft narkotika levering må nå svulsten mikromiljøet og ofte må skrive inn et bestemt intracellulære rommet, vanligvis ved endocytic opptak, for at stoffet skal oppnå ønsket terapeutisk effekt ^3. Nanopartikler er utformet for intracellulær levering av legemidler utnytte endocytose som en gateway inn i cellen, så vel som en rute for å overvinne medikamentresistensmekanismer. Drug utgivelse fra nanopartikler er ofte spesielt designet for å occur i lysosomer (dvs. lysosomotropic levering av legemidler) ⁶ hvor pH respons av nanopartikkel carrier (lysosomal pH ca. 4,5) kan tjene som trigger for medikamentfrigjørings eller lysosomale enzymer som frigjør nyttelasten fra transportøren ^7.

Mange forskjellige klasser av materialer kan brukes til å generere nanopartikler (for eksempel metaller og mange organiske og uorganiske materialer). Imidlertid er biopolymerer fremstår som attraktive materialer på grunn av deres kjente biokompatibilitet, nedbrytbarhet og lav toksisitet ^8. Mange biopolymerer blir undersøkt, inkludert albumin, alginat, kitosan og silke. Av disse har silke dukket opp som en lovende kandidat for utvikling i stoffet leveringssystemer ^9. Silke av forskjellige typer er produsert av et antall av leddyr, inkludert edderkopper (f.eks Nephila clavipes) og Silkeormer (f.eks silkeorm). Silkworm silke brukes langt mer extensivt enn edderkopp silke fordi silkeormen er fullt domestisert og dens silke representerer således en reproduserbar utgangsmateriale. Silkworm silke er en Food and Drug Administration (FDA) godkjente materialer for bruk på mennesker, spesielt som en sutur materiale; den har en robust sikkerhetshistorie hos mennesker, og er kjent for å nedbrytes in vivo ^10. Nedbrytningen profilen til silke kan være finjustert for å variere fra timer (lav krystallinsk silke) til 12 måneder eller mer (høy krystallinsk silke). Silke degraderingsprodukter er ikke-toksiske og metaboliseres i kroppen ^10. Silke struktur formidler evnen til å binde små molekylære forbindelser og makromolekylære protein narkotika ^11, noe som gjør det til et godt materiale for kontrollert legemiddeldosering. Protein medikamenter (f.eks antistoffer) er utsatt for denaturering, aggregasjon, proteolytisk spaltning og klaring av immunsystemet. Imidlertid stabiliserer silke terapeutiske proteiner på grunn av bufferkapasiteten til sin nanocrystalline gjenregioner og dens evne til å tilpasse vanninnhold på nanoskala ^11. Disse unike egenskapene gir fysisk beskyttelse og redusere nyttelasten mobilitet ¹¹ og er vanligvis ikke sett med andre (bio) polymerer. Mange anticancer stoffet leveringssystemer, for eksempel silke-baserte hydrogeler ^12, filmer ^13-15 og nanopartikler ^16,17, har nå blitt utviklet for å utnytte disse funksjonene (anmeldt i referanser ^18,19)

Her ble silkenanopartikler kjennetegnet ved å bestemme deres størrelse og ladning over en lengre tidsperiode. Doxorubicin, en klinisk relevant kreft narkotika, ble brukt som modell medikament for narkotika lasting og cytotoksiske studier i trippel negative menneskelige brystkreft celler behandlet med narkotikabelastede silke nanopartikler.

Protocol

1. Utarbeidelse av en Reverse-konstruert Silk Solution fra silkeorm Cocoons MERK: Denne metodikken er basert på protokoller som er beskrevet andre steder 12,27. Skjær 5 g tørket kokonger med saks inn i 5 mm x 5 mm stk. Fjern eventuelle skittent lag. Vei ut 4,24 g natriumkarbonat og legge dette nøye til 2 l kokende destillert vann. NB: Det oppnås en 0,02 M natriumkarbonat-løsning. Tilsett snitt kokong stykkene til den kokende natriumkarbonat-løsning…

Representative Results

Data ble statistisk analysert som beskrevet tidligere 17. Den t-test ble anvendt for prøve parene og en-veis analyse av varians (ANOVA) etterfulgt av Bonferroni multiple sammenlignings post hoc test for flere prøver. En asterisk angir statistisk signifikans som følger: * P <0,05 og ** P <0,001. Alle data er presentert som middelverdier ± standardavvik (SD) og tallene i parentes angir antall uavhengige eksperimenter. <p class="jove_content" fo:keep-together.within…

Discussion

Forskjellige metoder er tilgjengelige for å produsere silke nanopartikler, inkludert polyvinylalkohol blending ^20, spraytørke ^21, salting ut ^22, kapillær microdot utskrift ^23, superkritisk CO ₂ nedbør ²⁴ og nanoprecipitation ^16,25 (anmeldt i referanse ^26). Imidlertid nanoprecipitation, på grunn av dens generelle enkelhet, er den mest populære teknikk for generering av silke nanopartikler. Derfor hensikten med denne studien var …

Materials

Acetone	VWR International, Radnor, PA, USA	20066.33
Automated Critical Point Dryer	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	EM CPD300
Balancing	Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland	NewClassic MS
Black polystyrene microplate , 96 well	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	3991
Capillary cell (DTS 1070)	Malvern Instrument, Worcestershire, UK	DTS107
Carbon adhesive disc	Agar Scientific, Essex, UK	G3347N
Centrifuge	Hermle Labortechnik, Wehingen, Germany	Z323K
Centrifuge	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	Avanti J-E, Rotor: J20
Centrifuge	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	Optima L-70K, Rotor: 50.2 Ti, Adaptor 303392
Coater, low vacuum	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	EM ACE200
Cuvettes, polystyrene, disposable	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	FB55147
Doxorubixin	LC Laboratories, Boston, MA, USA	D4000
Electronic pipetting, Easypet	Eppendorf, Hamburg, Germany	N/A
FE-SEM	Hitachi High-Technologies, Krefeld, Germany	SU6600
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	16000-044
Freeze dryer	Martin Christ, Osterode, Germany	Epsilon 2-4
Heat inactivated Bombyx mori silk cocoons	Tajima Shoji, Kanagawa, Japan	N/A
Hotplate with Stirrer	Bibby Scientific, Stanffordshire, UK	US 152
Incubator	Memmert, Schwabach, Germany	INB 200
Insulin, human recombinant, zinc solution	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	12585-014
Lithium bromide	Acros Organics, Geel, Belgium	AC199870025
MDA-MB-231	ATCC, Manassas, VA, U.S.A	N/A
Micropipette and tips	Eppendorf, Hamburg, Germany	N/A
Microplate Reader	Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA	SpectraMax M5
Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes, 50 ml	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	N/A
Open-Top Thickwall Polycarbonate tube, 4 ml	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	355645
Penicilin/streptomycin	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	15140-122
RPMI medium	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	11875-093
Serological pipettes, 5 ml	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Silicon wafers	Agar Scientific, Essex, UK	G3391
Slide-A-Lyzer Dialysis cassettes, 3.5K MWCO, 15 ml	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	87724
Sodium carbonate anhydrous	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	S/2840/62
Specimen stubs for SEM	Agar Scientific, Essex, UK	G301
Ultrasonic homogenizer	Bandelin, Berlin, Germany	Sonoplus HD 2070
UV transparent microplate, 96 well	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	3635
Vortex	IKA, Staufen, Germany	Genius 3
Zetasizer	Malvern Instrument, Worcestershire, UK	Nano ZS
Zetasizer Software version 7.11			DLS software
Micro Modulyo	Thermo Fisher	230	Freeze drying system