Une méthode pour l'ARN de mesure N 6 -methyladenosine Modifications dans les cellules et de tissus

Summary

Une méthode Northern Blot modifiée pour mesurer ^N6- -methyladenosine (m ⁶ a) des modifications dans l' ARN est décrite. La méthode actuelle peut détecter des modifications dans divers ARNs et des contrôles en vertu de divers modèles expérimentaux.

Abstract

N 6-méthyladénosine (m⁶A) les modifications de l’ARN sont diverses et omniprésentes chez les eucaryotes. Ils sont présents dans l’ARNm, l’ARNr, l’ARNt et le microARN. Des études récentes ont révélé que ces modifications réversibles de l’ARN affectent l’épissage, la traduction, la dégradation et la localisation de l’ARN. De multiples processus physiologiques, tels que les rythmes circadiens, la pluripotence des cellules souches, la fibrose, le métabolisme des triglycérides et l’obésité sont également contrôlés par des modifications m⁶A. L’immunoprécipitation/séquençage, la spectrométrie de masse et le transfert de Northern modifié sont quelques-unes des méthodes couramment utilisées pour mesurer les modifications de m⁶A. Nous présentons ici une technique de transfert nord-est pour mesurer les modifications de m⁶A. Le protocole actuel offre une bonne séparation granulométrique de l’ARN, une meilleure adaptation et une meilleure normalisation pour divers modèles expérimentaux, et une délimitation claire des modifications de m⁶A dans diverses sources d’ARN. Bien que les modifications de m⁶A soient connues pour avoir un impact crucial sur la physiologie humaine en ce qui concerne les rythmes circadiens et l’obésité, leurs rôles dans d’autres états (patho)physiologiques ne sont pas clairs. Par conséquent, les recherches sur les modifications de m⁶A ont d’immenses possibilités de fournir des informations clés sur la physiologie moléculaire.

Introduction

Les modifications dynamiques et réversibles de l’ARN jouent un rôle important dans l’homéostasie de l’ARN. Il y a quarante ans, les modifications de la N6-méthyladénosine (m⁶A) se sont révélées abondantes dans les transcriptomes eucaryotes¹. Ils ont diverses fonctions dans l’ARN messager (ARNm), l’ARN ribosomique (ARNr), le petit ARN nucléolaire, l’ARN de transfert et le microARN². Les modifications m⁶A de l’ARNm influencent leur épissage³, leur traduction⁴, leur dégradation⁵ et leur localisation². De plus, ils affectent la biogenèse des ribosomes et la fonction des microARN⁶. La conservation évolutive des modifications m⁶A de l’ARN est notée chez les bactéries unicellulaires chez les humains multicellulaires⁷. La délimitation des rôles des modifications de m⁶A fait actuellement l’objet d’une exploration approfondie. On s’attend à ce que ces efforts fournissent de nouvelles informations sur le contrôle de la transcription. Des études récentes révèlent que d’autres modifications chimiques de l’ARNm⁸ jouent également un rôle essentiel dans le métabolisme de l’ARN.

Les rythmes circadiens⁹, la pluripotence des cellules souches¹⁰, le métabolisme des triglycérides⁴, la fibrose¹¹, l’obésité¹² et la dépression majeure¹³ sont quelques exemples de processus où les modifications de m⁶A sont connues pour contrôler les résultats. De nombreux transcrits de gènes de l’horloge circadienne ont m⁶A sites¹⁴. La modulation de la méthylase ou de la déméthylase m⁶provoque des changements de la période circadienne¹⁵. Mettl3, une transférase m⁶A, est un régulateur de la pluripotence des cellules souches. Une carence en Mettl3 entraîne une létalité embryonnaire précoce et un amorçage aberrant de la lignée au stade^{post-implantatoire 10}. Une carence en masse grasse et en obésité (FTO), une m⁶A déméthylase, dans les adipocytes affecte la mobilisation des acides gras et le poids corporel par la régulation post-transcriptionnelle d’Angptl4⁴. Ces études révèlent que m⁶A contrôle non seulement le traitement de l’ARNm, mais joue également un rôle essentiel dans le développement embryologique et la physiopathologie. La fonction des modifications m⁶A a des implications pour les considérations thérapeutiques à l’avenir.

Plusieurs méthodes sont disponibles pour mesurer les modifications m⁶A de l’ARN^16-18. Traditionnellement, la chromatographie sur couche mince (CCM) et la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) sont utilisées pour étudier la distribution de m⁶A dans plusieurs ARN^19,20. La spectrométrie de masse est un outil sensible pour la détection des modifications de m⁶A dans l’ARN. Cependant, l’ARN doit être excisé par la RNase en fragments courts avant d’être analysé par spectrométrie de masse²¹. L’immunoprécipitation et le séquençage de l’ARN-méthyle (m⁶A-Seq)²² immunoprécipitent les ARN fragmentés avec des anticorps spécifiques de m⁶A et effectuent un séquençage parallèle de l’ARN. Cette méthode génère des paysages m⁶A à l’échelle du transcriptome. La cartographie à haute résolution de la réticulation et de l’immunoprécipitation à résolution nucléotidique individuelle de m⁶A (miCLIP) cartographie davantage les modifications de m⁶A à une résolution de²³ pour un seul nucléotide. Les deux méthodes fournissent des détails sur la modification de m⁶A sur l’ensemble du transcriptome, avec des informations spécifiques sur les gènes. Cependant, les quantifications et la normalisation dans les deux méthodes sont difficiles si les expériences nécessitent la comparaison de plusieurs conditions. De plus, les fragmentations de l’ARN pour m⁶A-Seq modifient la structure originale de l’ARN, ce qui peut affecter les niveaux natifs de m⁶A. Pour détecter les modifications globales de l’ARN m⁶A et leurs changements dans différentes conditions expérimentales, nous rapportons une méthode qui utilise un protocole de transfert de Northern modifié. Cette méthode résout l’ARN en fonction de son poids moléculaire, en utilisant l’électrophorèse^{sur gel 18}. Cette procédure permet une meilleure normalisation et quantification des expériences impliquant plusieurs conditions ou échantillons. Il fournit également des informations spécifiques sur la modification de m⁶A pour différents ARN, qu’il s’agisse d’ARNr, d’ARNm ou de microARN.

Protocol

NOTE: Le m d'ARN total ⁶ Un niveau comprend l' ARNr, l' ARNm, et d' autres petits ARN. Depuis l' ARN ribosomal a abondant m ⁶ modifications A, la mesure de m ⁶ niveaux A devront tenir compte de ce fait.

1. Isolement de l'ARN

1. En utilisant la solution ribonucléase de décontamination (pulvérisée sur des serviettes en papier), essuyez les pipettes et les surfaces de laboratoire de banc. serviettes en papier humides avec de l'eau sans nucléase et essuyez pipettes et des surfaces de laboratoire de banc à nouveau.
2. Extraction d'ARN
   1. Isolement de l'ARN total
      1. En utilisant un agitateur suspendu, d' homogénéisation de 50 à 100 mg de tissu ou de 5-10 x 10 ⁶ cellules dans 1 ml de solution d'isolement d'ARN maintenu à 4 ° C.
         NOTE: Plus le tissu (100-150 mg) peuvent être nécessaires pour des échantillons de tissu adipeux de souris en raison des concentrations d'ARN inférieures qui y sont. Les échantillons proviennent de coeur de la souris, le foie, le muscle squelettique, du poumon, du cerveau, et les macrophages ont été employées précédemment ^4.
      2. Danscubate homogénats d'échantillons pendant 5 min à température ambiante.
      3. Ajouter 100 ul de 1-bromo-3-chloropropane (PCA) pour 1 ml d'échantillon d'homogénat. Agiter les tubes vigoureusement pendant 15 s et procéder à isoler l' ARN total selon les instructions du fabricant ^24.
   2. Polyadénylé de purification d'ARNm de l'ARN total isolé
      1. Purifier ARNm polyadénylés à l'aide de kits ou protocoles disponibles.
         1. Bien agiter pour remettre en suspension chacune des solutions suivantes: solution de liaison, oligo (dT) des billes de polystyrène, et une solution de lavage 2x. Assurez-vous que l'oligo (dT) Perles réchauffer à la température ambiante avant utilisation.
         2. Transférer 120 pi de solution d'élution par préparation dans un tube et on chauffe à 70 ° C dans un bloc chauffant.
         3. Pipeter jusqu'à 500 pg d'ARN total dans un tube de microcentrifugation. Avec de l'eau sans nucléase, ajuster le volume à 250 pi.
         4. Ajouter 250 pi de solution de liaison 2x à l'ARN total ainsirésolu- et brièvement vortex pour mélanger le contenu.
         5. Ajouter 15 ul d'oligo (dT) et des billes vortex pour mélanger à fond.
         6. Laisser incuber le mélange à 70 ° C pendant 3 min.
         7. Retirer l'échantillon du bloc de chauffage et le laisser reposer à température ambiante pendant 10 min.
         8. Centrifuger à 15000 g pendant 2 min.
         9. Retirez délicatement le surnageant, laissant environ 50 pi.
         10. Ajouter 500 pi de solution de lavage pour resuspendre le culot par pipetage.
         11. Pipeter la suspension dans un tube ensemble filtre rotatif / collection.
         12. Centrifuger à 15000 g pendant 2 min. Retirer la colonne du tube collecteur et jeter l'écoulement. Retour à la colonne du tube de collecte.
         13. Pipette 500 pi de solution de lavage sur le filtre de spin.
         14. Centrifugeuse à 15.000 x g pendant 2 min.
         15. Transférer le filtre rotatif dans un tube de collection fraîche.
         16. Introduire à la pipette 50 ul de solution d'élution chaufféà 70 ° C sur le centre du filtre rotatif.
         17. Incuber pendant 2-5 min à 70 ° C. Centrifuger à 15000 g pendant 1 min.
         18. Pipeter une 50 ul supplémentaires de solution d'élution chauffé à 70 ° C sur le centre du filtre rotatif.
         19. Répétez l'étape 1.2.2.1.18.
      2. Ajouter 100 pg / ml de glycogène, 0,1 volume de 3 M de tampon d'acétate de sodium (pH 5,2) et 2,5 volumes d'éthanol absolu. Précipiter nuit à -80 ° C.
      3. Centrifugeuse à 15.000 xg pendant 25 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
      4. Laver le culot avec 1 ml d'éthanol à 75%. Centrifugeuse à 15.000 xg pendant 15 min à 4 ° C. Retirez délicatement l'éthanol.
      5. Sec à l'air pendant 3-5 min.
      6. Ajouter 10 ul d'eau sans nucléase pour dissoudre le culot.
      7. Conserver à -70 ° C.
3. ARN Qualification et quantification
   1. À l'aide d'un spectrophotomètre, déterminer la concentration d'ARN par Notlng l'absorbance à 260 nm et 280 nm. Le rapport A ₂₆₀ / A ₂₈₀ devrait être de 1,8 à 2,2.
   2. Vérifier la qualité de l' échantillon d'ARN en utilisant 0,8% de gel d' agarose électrophorèse ^25.
      NOTE: L'ARN total eucaryote intact devrait montrer intenses bandes 28S et 18S. Le rapport de 28S par rapport 18S intensité de la bande pour une bonne préparation de l'ARN est ~ 2.

2. Gel Electrophoresis et le transfert

REMARQUE: Les protocoles de préparation de tampon sont donnés dans le tableau 1.

1. Préparation du gel de formaldehyde (1%)
   1. Rincer tout l'équipement d'électrophorèse avec de diéthyle (DEPC) l'eau.
   2. Faire fondre 2,5 g d'agarose dans 215 ml d'eau DEPC complètement dans un four à micro-ondes.
   3. Ajouter 12,5 ml de 10x 3- (N- morpholino) propanesulfonique (MOPS) tampon et 22,5 ml de 37% de formaldéhyde.
   4. Verser dans l'appareil d'électrophorèse avec un peigne à une épaisseur de 1,5 mm.
   5. Éliminer les bulles ou pousser tourlet sur les bords du gel avec un peigne propre.
   6. Permettre au gel de se solidifier à la température ambiante.
2. La préparation des échantillons
   1. Mélanger 1-10 ug de l'ARN total et 11,3 ul de tampon d'échantillon.
   2. Mélanger 2 pg du marqueur d'ARN (1 pg / pl) 11,3 pi de tampon d'échantillon.
   3. Ajouter de l'eau sans nuclease à partir des échantillons 2.2.1 et 2.2.2 à un volume total de 16 ul.
   4. Chauffer à 60 ° C pendant 5 min, puis refroidir sur la glace.
   5. Mélanger 16 ul de l'échantillon à partir 2.2.3 avec 4 pi de colorant de suivi, qui contient 0,1 pg / pl de bromure d'éthidium sur la glace.
      ATTENTION: Le bromure d'éthidium est peut-être tératogène et toxique en cas d'inhalation. Lire le bromure d'éthidium fiche de sécurité.
3. Electrophorèse
   1. Ajouter 200 ml de 10x MOPS tampon à 1.800 ml de ddH ₂ O pour faire un tampon de migration MOPS 1x.
   2. Utilisez le tampon en cours d'exécution 1x MOPS pour rincer les puits du gel.
   3. Pre-run til gel à 20 V pendant 5 min.
   4. Charger les échantillons d'ARN dans les puits du gel.
   5. Couvrir de papier d'aluminium pour éviter exposition à la lumière. Exécutez à 35 V pendant environ 17 h (pendant la nuit)
   6. Examiner et photographier le gel sous une lumière UV.
4. Transfert
   1. Couper le gel pour éliminer la portion inutilisée.
   2. Préparer 500 ml de 10 x tampon SSC (250 ml de tampon 20x SSC et 250 ml d'eau DEPC).
   3. Laver le gel deux fois avec un tampon 10x SSC pendant 20 minutes avec agitation à 50 tours par minute.
   4. Couper 1 filtre feuille de papier assez grand pour servir de document de mèche, qui absorbe un tampon de transfert à partir du plateau de transfert (Figure 1).
   5. Couper 4 morceaux de papier filtre à la même taille que le gel.
   6. Découper une feuille de membrane en nylon chargée positivement à la même taille que le gel.
   7. Marquer une encoche sur le gel et la membrane en tant que marqueur pour assurer l'orientation correcte.
   8. Faire tremper la membrane dans un tampon SSC 2x pendant 15 min.
   9. Verser 500 ml d'of 10x SSC tampon dans le bac de transfert.
   10. Poser la grande feuille de papier filtre sur la plaque de verre et le papier filtre humide avec un tampon de transfert.
   11. Etaler les bulles avec une pipette.
   12. Faire tremper 2 morceaux de papier filtre pré-découpé dans un tampon de transfert et les placer sur le centre du papier filtre de l'étape 2.4.5. Retirez toutes les bulles.
   13. Poser le côté supérieur de gel sur le papier filtre.
   14. Poser la membrane sur le dessus du gel. Aligner les encoches du gel et la membrane.
   15. Placer 2 morceaux de papier filtre pré-coupe sur le dessus de la membrane et le papier filtre avec un tampon de transfert humide.
   16. Retirez toutes les bulles entre les couches.
   17. Appliquer un film plastique autour du gel pour assurer que les serviettes seulement absorbent le tampon qui passe à travers le gel et la membrane.
   18. Empilez les serviettes en papier sur le dessus du papier filtre.
   19. Placer une plaque de verre surdimensionné sur le dessus des serviettes.
   20. Placer un poids sur le dessus de la pile.
   21. Maintenir pendant une nuit pour permettre à l'ARN de transférer du gel vers la membrane.

3. Détection de la N ⁶ -methyladenosine

1. Membrane Réticulation
   1. Gardez la membrane humide dans un tampon 2x SSC.
   2. Placez 2 feuilles de papier filtre immergé avec 10x tampon SSC en réticulant UV.
   3. Placer la membrane sur le dessus du papier-filtre, le côté de l'ARN adsorbé vers le haut.
   4. Sélectionnez "mode autocrosslink" (120.000 pJ) et appuyez sur le bouton "Démarrer" pour lancer l'irradiation.
   5. Examiner la membrane et le gel avec un gel UV image receveur pour confirmer le transfert de l'ARN du gel à la membrane.
2. immunotransfert
   1. Bloquer la membrane dans 5% de lait dégraissé dans une solution salée tamponnée au Tris avec du Tween 20 (TBST), un tampon à température ambiante pendant 1 h.
   2. Laver trois fois avec du tampon TBST pendant 15 min.
   3. Incuber la membrane pendant une nuit à ⁶ m A ( N ⁶ -methyladenosine) solution d'anticorps (1: tampon TBST de lait non gras 1000 dans 5%) à 4 ° C.
   4. Laver la membrane trois fois avec le tampon TBST pendant 15 min.
   5. Incuber la membrane dans la solution d'âne conjugué à HRP anti-lapin d'anticorps (1: 2000 dans du tampon TBST de lait non gras à 5%) pendant 1 h à température ambiante.
   6. Laver la membrane trois fois avec le tampon TBST pendant 15 min.
   7. Appliquer le substrat de chimioluminescence amélioré (0,125 ml par ^cm2 de membrane).
   8. Capturez la chimioluminescence avec les réglages optimaux de l'imageur numérique, selon les instructions du fabricant ^26.
3. m ⁶ A Quantification
   1. Mesurer la m ⁶ Une intensité de chimioluminescence par rapport à l' aide du logiciel ImageJ.
      1. Dans le menu du logiciel ImageJ, sélectionnez l'option "Fichier" pour ouvrir le fichier pertinent.
      2. Sélectionnez l'outil "Rectangle" de ImageJ et dessiner un cadre autourles signaux.
      3. Si l' ARN ribosomal est pas l'objet des expériences, d' éviter les 18S et 28S ribosomal RNA m ⁶ bandes A pour le calcul.
      4. Cliquez sur "Command" et "1" pour confirmer la voie sélectionnée.
      5. Appuyez sur "commande" et "3" pour afficher le tracé sélectionné.
      6. Cliquez sur l'outil "Straight" et tracer des lignes pour séparer la zone segmentée.
      7. Cliquez sur l'outil "baguette" pour enregistrer les mesures.
      8. Exporter les données.
      9. Normaliser les niveaux de m ⁶ A avec l'ARN ribosomal 18S bande à partir de la coloration au bromure d'éthidium.

Results

Après 14 jours en phase circadienne de lumière-obscurité normale, les souris de type sauvage ont été placés dans l'obscurité constante. Les ARN du foie ont été prélevés à des intervalles de 4 h et étudiés avec Northern Blot modifiée. La méthylation des ARNr, d' ARNm et de petits ARN ont été clairement détectée (figure 2). La comparaison entre les différents moments circadiens (CT) peut être calculé avec précision le niveau ARNr 18S. Il était robuste oscillation circadienne de m ⁶ niveaux A à ARNr, l' ARNm, et les petits ARN.

Afin d'éviter l'interférence avancé par un ARNr, un ARN polyadénylés peuvent être purifiés comme à l'étape 1.2.2. Après purification, le rARN peut être largement éliminé pour permettre une meilleure visualisation des autres ARN (figure 3).

g> Figure 1: Montage de l'unité de transfert de blot. L'unité de transfert capillaire pour buvard l'ARN sur la membrane est représentée. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2: le rythme circadien des m ⁶ niveaux A à C57BL / 6J. Cette figure montre la m ⁶ Un transfert de l' ARN total à partir de foies de souris de type sauvage a sacrifié le premier jour de la phase sombre sombre après 14 jours d'une phase de lumière-obscurité normale à 4 heures d' intervalle. La quantification a été effectuée en utilisant les ⁶ m Une différence de densité d'image entre rARN 18S et 28S. M ⁶ Une abondance a été étalonnée par rapport à la bande 18S du gel de formaldehyde au fond.et = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: m ^6a blots avec ou sans ARNr. M représentant ⁶ A blot de l' ARN total et de l' ARN polyadénylé à partir de foies de souris de type sauvage sont présentées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1: Tampons et solutions.

1	tampon 10x MOPS (pH 7,0, protéger de la lumière)
	MOPS			41.85	g	0,2 M
	L'acétate de sodium			4.1	g	0,05 M
	EDTA, le sel de disodium			3.7	g	0,01 M
	l'eau DEPC
	Total			1	L
	On agite à la température ambiante
2	tampon de SSC 20x (pH 7,0)
	Chlorure de sodium			175,3	g	3 M
	Citrate trisodique			88,3	g	0,3 M
	l'eau DEPC
	Total			1	L
	Agiter à la température ambiante, puis l'autoclave
3	Dye Suivi
	tampon 10x MOPS			500	ul	1 fois
	Ficoll 400			0,75	g	15%
	bleu de bromophénol			0,01	g	0,2%
	Xylène Cyanol			0,01	g	0,2%
	l'eau DEPC
	Total			5	mL
	Conserver à -20 ° C
4	l'eau DEPC
	Diluer ratio à 1: 1.000 de DEPC dans ddH 2 O
	Agiter pendant une nuit à température ambiante, puis l'autoclave
5	tampon d'échantillon (abri de la lumière)
	tampon 10x MOPS			200	ul
	37% de formaldéhyde			270	ul
	formamide			660	ul
	Conserver à -20 ° C

Discussion

Les modifications de l’ARN jouent un rôle important dans la fonction cellulaire et la physiologie. La compréhension actuelle de la régulation, de la fonction et de l’homéostasie de ces modifications est encore en cours d’exploration et d’expansion⁸. Par conséquent, une méthode précise et de référence pour évaluer les modifications de l’ARN est nécessaire. La méthode de transfert de Northern modifiée permet une quantification précise des modifications de l’ARN et une délimitation claire des modifications dans divers ARN. Bien que la méthode nécessite au moins 3 jours, elle peut être normalisée et peut être utilisée dans divers modèles expérimentaux. De plus, avec différents anticorps, il peut détecter différentes modifications de l’ARN²⁷.

Il est important de séparer les différents ARN lors de l’analyse des modifications de l’ARN. L’ARN ribosomique représente une grande partie de la quantité totale d’ARN^28,29. Les résultats de l’analyse des modifications de l’ARN uniquement dans l’ARN total représenteront principalement les changements de l’ARNr. La méthylation et d’autres modifications de l’ARNr pourraient potentiellement masquer les changements dans d’autres ARN. Avec la procédure de séparation sur gel, les modifications de l’ARNm et d’autres petits ARN peuvent être analysées avec plus de précision.

La cartographie à l’échelle du transcriptome avec immunoprécipitation et séquençage de m⁶A fournit un aperçu détaillé de la modification de chaque type d’ARN²². Il fournit des informations sur les ARN spécifiques et une résolution d’environ 80-120 pb. Bien que m⁶A-Seq puisse comparer les modifications entre différentes conditions expérimentales, le choix d’étalons et de contrôles appropriés pour de telles expériences est difficile¹⁸. L’immunoprécipitation est difficile à reproduire, donnant souvent des variations importantes entre les répétitions. De plus, m⁶A-Seq nécessite la fragmentation des échantillons d’ARN avant l’immunoprécipitation et le séquençage³⁰. Le processus de fragmentation pourrait potentiellement induire des influences indues sur les modifications de l’ARN d’origine. Si l’expérience n’a pas besoin de l’information du gène spécifique mais nécessite des conditions différentes pour la comparaison, la méthode actuelle offre une meilleure visualisation et un meilleur contrôle pour diverses configurations expérimentales.

La modification de l’ARN est une étape importante dans la régulation du contrôle transcriptionnel³¹. Cependant, l’homéostasie et les mécanismes de régulation de diverses modifications de l’ARN dans divers domaines physiologiques ne sont pas encore clairs. À l’aide de la méthode actuelle de transfert du Nord modifié, différentes modifications de l’ARN peuvent être quantifiées et comparées. De plus, les changements et les régulations des modifications de l’ARN peuvent être étudiés plus en détail. À l’avenir, il pourrait également être possible de combiner les données expérimentales du transfert du Nord classique et des protocoles modifiés du transfert du Nord, ce qui permettrait de mieux comprendre la biologie de l’ARN.

Le facteur le plus important qui détermine le succès du protocole de transfert de Northern modifié est l’intégrité de l’échantillon d’ARN. Les ARN présentant une certaine quantité de dégradation peuvent donner de bons résultats de transfert de Northern classique, mais cela pourrait avoir un impact significatif sur les résultats de transfert de Northern modifiés. Les modifications de l’ARN dans différents tissus ou lignées cellulaires peuvent également varier considérablement. Il est important de tester les charges d’échantillons d’ARN appropriées pour différents tissus avant d’effectuer les expériences finales.

Comme les procédures de transfert ont traditionnellement été nommées d’après le Dr Southern et différentes directions géographiques, nous proposons le nom de transfert « nord-est » pour la technique actuelle.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solution RNaseZap	Ambion	AM9782	Protocole 1.1
TRI Solution réactive	Ambion	AM9738	Protocole 1.2.1.1
1-Bromo-3-chloropropane (BCP)	Sigma	B9673	Protocole 1.2.1.3
Éthanol	JTbaker	8006	Protocole 1.2.1.3
Isopropanol	Sigma	I9516	Protocole 1.2.1.3
GenElute mRNA Miniprep Kit	Sigma	MRN70	Protocole 1.2.2.1
Glycogène	Ambion	AM9510	Protocole 1.2.2.2
Acétate de sodium	Fluka	71183	Protocole 1.2.2.2
Eau sans nucléase	Ambion	AM9930	Protocole 1.2.2.6
DEPC	Sigma	D5758	Protocole 2.1.1
Agarose	JT Baker	A426	Protocole 2.1.2
MOPS	Sigma	M1254	Protocole 2.1.3
37 % formaldéhyde Solution	Sigma	F8775	Protocole 2.1.3
EDTA, sel disodique	JT Baker	8993	Protocole 2.1.3 10x MOPS
buffer formamide	Sigma	F7503	Protocole 2.2.1
ARN Millennium Marker	Ambion	AM7150	Protocole 2.2.2
Bromure d’éthidium	Amresco	X328	Protocole 2.2.5
Ficoll PM400	GE Healthcare	17-0300-10	Protocole 2.2.5 colorant de suivi
Bleu de bromophénol	Sigma	114391	Protocole 2.2.5 colorant de suivi
Xylène Cyanol FF	Sigma	X4126	Protocole 2.2.5 colorant de suivi
Chlorure de sodium dihydraté	JT Baker	3624	Protocole 2.4.2 20x Tampon SSC
Citrate trisodique	Sigma	S1804	Protocole 2.4.2 20x Tampon SSC
Hybond Blotting Paper	GE Healthcare	RPN6101M	Protocol 2.4.4
Membrane GE Hybond-N+	GE Healthcare	RPN303B	Protocol 2.4.6
Stratalinker UV Crosslinker 2400	Stratagene	400075	Protocol 3.1.2
Gel Catcher 1500	Technologie ANT	Gel Catcher 1500	Protocole 3.1.5
Anti-m6A (N6-méthyladénosine)	Synaptic Systems	202003	Protocol 3.2.3
Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, HRP-lied whole Ab	GE Healthcare	NA934	Protocol 3.2.5
ChemiDoc MP System	BIO-RAD	1708280	Protocol 3.2.8