Parallel Måling af døgnrytmen ur genekspression og hormon sekretion i Human primære cellekulturer
Summary
Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.
Abstract
Døgnrytmen ure er funktionelle i alle lysfølsomme organismer, der giver mulighed for en tilpasning til den ydre verden ved at foregribe daglige miljøforandringer. Der er gjort betydelige fremskridt i vores forståelse af den stramme forbindelse mellem døgnrytmen ur og de fleste aspekter af fysiologi i feltet i det sidste årti. Men unraveling den molekylære basis, der ligger til grund for funktionen af døgnrytmen oscillator i mennesker forbliver af højeste teknisk udfordring. Her giver vi en detaljeret beskrivelse af en eksperimenterende tilgang til langsigtet (2-5 dage) bioluminescens optagelse og udstrømning medium kollektion i dyrkede humane primære celler. Til dette formål har vi transduceret primære celler med en lentiviral luciferase reporter, der er under kontrol af en kerne ur genpromotor, der tillader den parallelle vurdering af hormonsekretion og døgnrytmen bioluminescens. Desuden beskriver vi betingelserne for at forstyrre døgnrytmen ur i PRimary humane celler ved transfektion siRNA targeting ur. Vores resultater på circadian regulering af insulinsekretion ved humane pancreas-øer, og myokine sekretion fra humane skeletmuskelceller, præsenteres her for at illustrere anvendelsen af denne metode. Disse indstillinger kan bruges til at studere den molekylære sammensætning af humane perifere ure og analysere deres funktionelle virkninger på primære celler under fysiologiske eller patofysiologiske tilstande.
Introduction
Det døgnrytmen timing systemet (fra latin "Circa diem") er dukket op i alle lysfølsomme organismer, som en adaptiv mekanisme til rotation af Jorden. I pattedyr er det organiseret i en hierarkisk måde, der omfatter den centrale ur, som er beliggende i suprachiasmatic nucleus af den ventrale hypothalamus, og perifer (eller slave) oscillatorer, der er operativ i forskellige organer. Desuden er disse celleautonom selvbærende oscillatorer er funktionelle i næsten hver eneste celle i kroppen 1. Photic signaler repræsenterer en dominerende synkronisering cue (zeitgeber) for SCN neuroner, hvorimod neurale og humorale signaler stammer fra SCN nulstille perifere ure. Derudover hvile-aktivitet rytmer, der kører til gengæld fodring-fastende cykler, er yderligere synchronizers for perifere ure 2. Ifølge vores nuværende forståelse, er den molekylære sammensætning af kernen ur baseret på transkriptionel og oversætnelle feedback-sløjfer, som er konserveret mellem organismer. Dette omfatter transkriptionelle aktivatorer BMAL1 og ur, der tilsammen aktiverer transskription af de negative core clock PER og råb gener. Høje niveauer af PER og råb proteiner vil hæmme deres egen transskription gennem hæmning af BMAL1 / CLOCK kompleks. En ekstra sløjfe består af de nukleare receptorer REV-Erbs og lene, som også regulerer transkription af BMAL1 og CLOCK. Desuden posttranslationelle begivenheder, herunder fosforylering, sumoylation, acetylering, O-GlcNAcylation, nedbrydning og nuklear bogføring af centrale ur proteiner udgør en yderligere vigtig regulerende lag i oprettelse af 24 timers svingning cyklus 3.
Akkumulerende beviser stammer fra studier i gnavermodeller og fremhæver den afgørende rolle døgnrytmen system i koordineringen af metaboliske og endokrine funktioner 4-5. En række kore-skala transkriptom analyse finder, at fodring – fastende cyklusser spiller en central rolle i synkroniseringen af perifere oscillatorer 6-8. I en aftale med disse undersøgelser, har metabolomisk og lipidomic analyse hos gnavere og mennesker viste, at et stort antal metabolitter oscillere i væv, plasma og spyt i et døgnrytmen måde 9-11. Vigtigere, de fleste hormoner udviser døgnrytmer i blod 5,12-13. Desuden kan døgnrytmen ure den tilsvarende hormon producerer perifere væv regulere hormon sekretion lokalt. Celle-autonom cirkadiske oscillatorer er blevet beskrevet i gnavere og humane pancreas-ø-celler 14-16. Disse oscillatorer spiller en væsentlig rolle i reguleringen af pancreas-ø transkriptom og funktion 15,17-18. Desuden myokine sekretion af menneskelige skelet myorør er for nylig blevet demonstreret at udvise en døgnrytmen mønster, som reguleres af celle-autonome oscillators operative i disse celler 19.
Flere metoder til at studere døgnrytmen hos mennesker in vivo er ofte blevet brugt. For eksempel har plasma melatonin eller cortisolniveauer samt thorax hudoverfladen temperatur (gennemgået i referencerne 3,20) blevet undersøgt for at vurdere endogene cirkadiske ure. Selv om disse metoder tillader studerer systemiske cirkadiske svingninger i vivo, de er langt fra at give en pålidelig vurdering af fritløbende autonome døgnrytmen i forskellige organer og væv. Ikke desto mindre vil en sådan dissektion fra den systemiske regulering være et uundværligt redskab til at forstå den specifikke effekt af intracellulære molekylære ure på funktionen af disse celler. Derfor er der foretaget en betydelig indsats for at udvikle pålidelige metoder til at studere menneskelige ure i immortaliserede eller primære dyrkede celler synkroniseret in vitro. Vigtigere er det blevet påvist, atur egenskaber målt i dyrkede primære hudfibroblastceller nøje afspejler de enkelte ur egenskaber af hele organismen 21. Udviklingen af fluorescerende og bioluminiscerende døgnrytmen journalister har i høj grad avancerede denne tilgang 22-27. Desuden studerer primære celle ure, der er afledt af forskellige perifere organer giver mulighed for undersøgelse af de molekylære egenskaber af humane vævsspecifikke ure 3,5,16,19-20,28. Således vurdering af døgnrytmen ure i in vitro-synkroniserede primære eksplantater eller celler, ved hjælp af bioluminescerende reportere, repræsenterer en meget nyttig metode til at studere den molekylære sammensætning af humane perifere ure og deres indvirkning på organfunktion.
I denne artikel vil vi præsentere detaljerede protokoller til vurdering døgnrytmen genekspression i humane primære ø og skelet muskelceller synkroniseret in vitro samt virkningen af autonome cellulære urforstyrrelser på den sekretoriske funktion af disse celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Forsøgsopstillingen beskrives her er sammensat af lentiviral levering af døgnrytmen bioluminescens reportere i dyrkede humane primære celler, efterfulgt af efterfølgende in vitro synkronisering og kontinuerlig registrering af bioluminescens i flere dage, og parallel analyse af hormonsekretion af de samme celler. De repræsenterer en effektiv metode til at udforske molekylære mekanismer og funktionelle aspekter af døgnrytmen ure i humane primære celler.
Kvaliteten af don…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige for vores kolleger fra universitetet i Genève: Jacques Philippe for konstruktive kommentarer til dette arbejde, Ueli Schibler for uvurderlig hjælp med udviklingen af perifusion-systemet og for videnskabelig inspiration, André Liani for at have udtænkt design, fremstilling og idriftsættelse af perfusionssystemet, Lesa-Technology LTD selskab for bistand i perifusion systemet og Dryp-biolumicorder softwareudvikling, George Severi for assistance med perifusion eksperimenter, Ursula Loizides-Mangold for kritisk læsning af manuskriptet, og Anne-Marie Makhlouf for lentivirus præparater ; til Etienne Lefai, Stéphanie Chanon og Hubert Vidal (INSERM, Lyon) for at forberede humane primære myoblaster; og til Domenico Bosco og Thierry Berney (Human Islet Transplantation Center, Genève Universitetshospital) til at tilvejebringe humane øer. Dette arbejde blev finansieret af den schweiziske National Science Foundation Grant No. 31003A_146475 / 1, Sinergia Swiss National Science Foundation Grant No. CRSII3-154405, Fondation Romande pour la Recherche sur diabete, Bo Hjelt Foundation, Fondation Ernst et Lucie Schmidheiny, og Société Académique de Genève (CD).
Materials
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | For muscle biopsy digestion |
| DPBS no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190-094 | |
| HAM F-10 | Invitrogen | 41550-021 | For myoblasts culture |
| FBS | Invitrogen | 10270 | Supplement to culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781-100 | Supplement to culture medium |
| Gentamycin | Axon | A1492.0001 | Supplement to culture medium |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-026 | Amphotericin B, supplement to culture medium |
| DMEM 1g/L glucose + Na pyruvate + glutamax | Invitrogen | 21885-025 | For myotubes culture |
| DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvate – glutamax | Invitrogen | 11880-028 | Recording medium for LumiCycle |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-028 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide, supplement to recording medium |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | Cell detachment solution, for islet cell dissociation |
| CMRL | Gibco | 21530-027 | Culture medium for islet cells |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-039 | Supplement to culture medium |
| 15 ml High-Clarity Polipropylene Conical Tube | Falcon | 352096 | |
| F75 flask | BD Falcon | 353136 | |
| 3.5 cm Petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| Foskolin | Sigma | F6886 | Adenylyl cyclase activator, used for synchronization |
| Luciferin | Prolume LTD | 260150 | Supplement to recording medium |
| OptiMEM | Invitrogen | 51985-026 | Serum-free Minimal Essential Medium (MEM) used for human islet cells transfection |
| Lipofectamine RNAiMAX reagent | Invitrogen | 13778-150 | Transfection reagent |
| HiPerFect reagent | Qiagen | 301705 | Transfection reagent |
| ON-TARGET plus siCLOCK smartpool | Dharmacon | L-008212-00 | |
| ON-TARGET plus non targeting siRNA #1 (siControl) | Dharmacon | D-001810-01 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For myotubes DNA extraction |
| RNeasy Plus Mini kit | Qiagen | 74104 | For myotubes RNA extraction |
| QIAshredder | Qiagen | 79654 | For myotubes RNA extraction |
| 2 ml collecting tubes | Axygen | 311-10-051 | To collect the medium with the perifusion |
| Tissue culture Plate, 6 Well | BD Falcon | 353046 | To collect the medium with the perifusion |
| RNeasy Plus Micro kit | Qiagen | 74034 | For islet RNA extraction |
| Human IL-6 Instant ELISA kit | eBioscience | 88-7066-22 | |
| Human Insulin Kit Mercodia | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Hydrochloric acid, min,37%,p.a. | Acros organics | 124630010 | Used for preparation of lysis buffer (375ml Ethanol+7.5%HCl+117.5%H2O) |
| Ethanol (>99.8%) | Fluka Analytical | 02860-1L | Used for preparation of lysis buffer (375ml Ethanol+7.5%HCl+117.5%H2O) |
| Human Islets for Research | Prodo Laboratories | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R | |
| Water bath | VWR | 1112A | at 37 °C |
| Tissu culture hood | Faster | SafeFastElite | |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | 5% CO2 at 37 °C |
| Shaker | Heidolph Instruments | Unimax 1010 | For agitation of the siRNA mix |
| LumiCycle | Actimetrics | ||
| LumiCycle software | Actimetrics | ||
| CosinorJ software | EPFL | Freely available at: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/ | |
| Rheodyne titan MX | ERC GmbH | Control software that controls the timing of the automated switch | |
References
- Albrecht, U. Timing to perfection: the biology of central and peripheral circadian clocks. Neuron. 74 (2), 246-260 (2012).
- Dibner, C., Schibler, U., Albrecht, U. The mammalian circadian timing system: organization and coordination of central and peripheral clocks. Annu Rev Physiol. 72, 517-549 (2010).
- Dibner, C., Schibler, U. Circadian timing of metabolism in animal models and humans. J Intern Med. , (2015).
- Marcheva, B., et al. Circadian clocks and metabolism. Handb Exp Pharmacol. (217), 127-155 (2013).
- Philippe, J., Dibner, C. Thyroid circadian timing: roles in physiology and thyroid malignancies. J Biol Rhythms. 30 (2), 76-83 (2015).
- Andrews, J. L., et al. CLOCK and BMAL1 regulate MyoD and are necessary for maintenance of skeletal muscle phenotype and function. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 19090-19095 (2010).
- McCarthy, J. J., et al. Identification of the circadian transcriptome in adult mouse skeletal muscle. Physiol Genomics. 31 (1), 86-95 (2007).
- Shostak, A., Husse, J., Oster, H. Circadian regulation of adipose function. Adipocyte. 2 (4), 201-206 (2013).
- Dallmann, R., Viola, A. U., Tarokh, L., Cajochen, C., Brown, S. A. The human circadian metabolome. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2625-2629 (2012).
- Adamovich, Y., et al. Circadian clocks and feeding time regulate the oscillations and levels of hepatic triglycerides. Cell Metab. 19 (2), 319-330 (2014).
- Chua, E. C., et al. Extensive diversity in circadian regulation of plasma lipids and evidence for different circadian metabolic phenotypes in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14468-14473 (2013).
- Kalsbeek, A., Fliers, E. Daily regulation of hormone profiles. Handb Exp Pharmacol. (217), 185-226 (2013).
- Hastings, M., O’Neill, J. S., Maywood, E. S. Circadian clocks: regulators of endocrine and metabolic rhythms. J Endocrinol. 195 (2), 187-198 (2007).
- Muhlbauer, E., Wolgast, S., Finckh, U., Peschke, D., Peschke, E. Indication of circadian oscillations in the rat pancreas. FEBS Lett. 564 (1-2), 91-96 (2004).
- Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
- Pulimeno, P., et al. Autonomous and self-sustained circadian oscillators displayed in human islet cells. Diabetologia. 56 (3), 497-507 (2013).
- Perelis, M., et al. Pancreatic beta cell enhancers regulate rhythmic transcription of genes controlling insulin secretion. Science. 350 (6261), (2015).
- Saini, C., et al. A functional circadian clock is required for proper insulin secretion by human pancreatic islet cells. Diabetes Obes Metab. , (2015).
- Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4 (11), 834-845 (2015).
- Saini, C., Brown, S. A., Dibner, C. Human peripheral clocks: applications for studying circadian phenotypes in physiology and pathophysiology. Front Neurol. 6, 95 (2015).
- Brown, S. A., et al. Molecular insights into human daily behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (5), 1602-1607 (2008).
- Asher, G., et al. SIRT1 regulates circadian clock gene expression through PER2 deacetylation. Cell. 134 (2), 317-328 (2008).
- Dibner, C. On the robustness of mammalian circadian oscillators. Cell Cycle. 8 (5), 681-682 (2009).
- Dibner, C., et al. Circadian gene expression is resilient to large fluctuations in overall transcription rates. EMBO J. 28 (2), 123-134 (2009).
- Nagoshi, E., et al. Circadian gene expression in individual fibroblasts: cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 119 (5), 693-705 (2004).
- Sage, D., Unser, M., Salmon, P., Dibner, C. A software solution for recording circadian oscillator features in time-lapse live cell microscopy. Cell Div. 5, (2010).
- Kowalska, E., Moriggi, E., Bauer, C., Dibner, C., Brown, S. A. The circadian clock starts ticking at a developmentally early stage. J Biol Rhythms. 25 (6), 442-449 (2010).
- Mannic, T., et al. Circadian clock characteristics are altered in human thyroid malignant nodules. J Clin Endocrinol Metab. 98 (11), 4446-4456 (2013).
- Parnaud, G., et al. Proliferation of sorted human and rat beta cells. Diabetologia. 51 (1), 91-100 (2008).
- Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. Isolation and quantitative immunocytochemical characterization of primary myogenic cells and fibroblasts from human skeletal muscle. J Vis Exp. (95), e52049 (2015).
- Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genet. 4 (2), e1000023 (2008).
- Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: an efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. J Biol Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
- Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Mol Metab. 3 (1), 29-41 (2014).
- Innominato, P. F., et al. The circadian timing system in clinical oncology. Ann Med. 46 (4), 191-207 (2014).
- Chitikova, Z., et al. Identification of new biomarkers for human papillary thyroid carcinoma employing NanoString analysis. Oncotarget. 6 (13), 10978-10993 (2015).
- Pagani, L., et al. The physiological period length of the human circadian clock in vivo is directly proportional to period in human fibroblasts. PLoS One. 5 (10), e13376 (2010).
