الاستفادة من مجمع بين الافراج عن الإثيلين، حمض 2-Chloroethylphosphonic، كأداة لدراسة استجابة الإثيلين في البكتيريا
Summary
The protocols outlined herein facilitate the convenient investigation of bacterial ethylene responses by utilizing 2-chloroethylphosphonic acid (CEPA). Ethylene is produced in situ through the decomposition of CEPA in an aqueous bacterial growth medium, circumventing the requirement for pure ethylene gas.
Abstract
Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ripening. Exogenous ethylene applied during early plant development triggers the triple response phenotype; a shorter and thicker hypocotyl with an exaggerated apical hook. Despite the intimate relationship between plants and bacteria, the effect of exogenous ethylene on bacteria has been greatly overlooked. This is partly due to the difficulty of controlling gaseous ethylene within the laboratory without specialized equipment. 2-Chloroethylphosphonic acid (CEPA) is a compound that decomposes into ethylene, chlorine, and phosphate in a 1:1:1:1 molar ratio when dissolved in an aqueous medium of pH 3.5 or greater. Here we describe the use of CEPA to produce in situ ethylene for the investigation of ethylene response in bacteria using the fruit-associated, cellulose-producing bacterium Komagataeibacter xylinus as a model organism. The protocols described herein include both the verification of ethylene production from CEPA via the Arabidopsis thaliana triple response assay and the effects of exogenous ethylene on K. xylinus cellulose production, pellicle properties and colonial morphology. These protocols can be adapted to examine the effect of ethylene on other microbes using appropriate growth media and phenotype analyses. The use of CEPA provides researchers with a simple and efficient alternative to pure ethylene gas for the routine determination of bacterial ethylene response.
Introduction
الاثيلين الأوليفين (C 2 H 4) اكتشفت لأول مرة كما هرمون مصنع في عام 1901 عندما لوحظ أن الشتلات البازلاء، ونمت في المختبر التي تستخدم مصابيح الغاز والفحم، وعرضت على التشكل الشاذ الذي ينبع كانت (hypocotyls) أقصر، وأكثر سمكا وعازمة جانبية مقارنة الشتلات البازلاء العادية. وصف النمط الظاهري في وقت لاحق 1،2 استجابة الثلاثي. أثبتت الدراسات اللاحقة أن الاثيلين هو هرمون نباتي الحيوي الذي ينظم العمليات التنموية العديدة مثل النمو والاستجابة للضغط النفسي، نضج الثمار والشيخوخة 3. thaliana نبات الأرابيدوبسيس، كائن نموذج للأبحاث بيولوجيا النبات، قد درست جيدا في ما يخص ردها على الإيثيلين. وقد تم عزل المسوخ استجابة العديد من الاثيلين من خلال استغلال النمط الظاهري استجابة الثلاثي لوحظ في الظلام نمت أ. الشتلات thaliana في وجود من الاثيلين 1،4،5. مقدمة السكروز لإنتاج الإثيلين في النباتات هو 1-لحمض minocyclopropane الكربوكسيلية (ACC) 6، ويستخدم عادة خلال فحص استجابة الثلاثي لزيادة انتاج الاثيلين الذاتية التي تؤدي إلى الثلاثي 1،4،5 استجابة النمط الظاهري.
على الرغم من أن استجابة الاثيلين تدرس على نطاق واسع في النباتات، ودراسة سلوكه تأثير الاثيلين دخيلة على البكتيريا إلى حد كبير على الرغم من ارتباط وثيق من البكتيريا مع النباتات. ذكرت إحدى الدراسات أن بعض سلالات الزائفة يمكن البقاء على قيد الحياة باستخدام الاثيلين كمصدر وحيد للكربون والطاقة 7. ومع ذلك، فقد أظهرت اثنين فقط من الدراسات أن البكتيريا تستجيب للالاثيلين. وأظهرت الدراسة الأولى أن سلالات الزائفة الزنجارية، P. المتألقة، P. الكريهة، وP. كانت syringae الكيميائي نحو الاثيلين باستخدام فحص المكونات الاغاروز التي الاغاروز المنصهر كانت مختلطة مع العازلة الكيميائي معايرتها مع غاز الاثيلين النقي 8. ومع ذلك، على حد علمنا، لم تكن هناك أي فورثتقارير إيه باستخدام غاز الاثيلين النقي لتوصيف استجابة الاثيلين البكتيرية، ويرجح ذلك بسبب صعوبة التعامل مع الغازات في المختبر بدون المعدات المتخصصة. أظهر التقرير الثاني للاستجابة الاثيلين البكتيرية التي الاثيلين زاد إنتاج السليلوز البكتيريا والتعبير الجيني أثرت في البكتيريا المصاحبة الفاكهة، Komagataeibacter (سابقا Gluconacetobacter) xylinus 9. في هذه الحالة، ومجمع الإفراج الإثيلين، واستخدم حمض 2-chloroethylphosphonic (CEPA) لإنتاج الإثيلين في الموقع في المتوسط نمو البكتيريا، تجاوز الحاجة للغاز الاثيلين النقي أو المعدات المتخصصة.
CEPA تنتج الاثيلين في نسبة 1: 1 الرحى فوق درجة الحموضة 3.5 10،11 من خلال المحفز الأساس، من الدرجة الأولى رد فعل 12-14. ويرتبط تدهور CEPA بإيجابية مع الرقم الهيدروجيني ودرجة الحرارة 13،14 والنتائج في إنتاج إيثيلإيني، كلوريد والفوسفات. يوفر CEPA الباحثين المهتمين بدراسة ردود البكتيرية إلى الإثيلين مع بديل مناسب لالاثيلين الغازي.
ويتمثل الهدف العام من البروتوكولات التالية هو توفير وسيلة بسيطة وفعالة لدراسة استجابة الاثيلين البكتيرية ويتضمن المصادقة على المستويات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية لانتاج الاثيلين من CEPA التحلل في المتوسط نمو البكتيريا، وتحليل درجة الحموضة الثقافة لضمان CEPA لم تضعف التحلل خلال نمو البكتيريا، وتقييم تأثير الاثيلين على مورفولوجيا البكتيرية والنمط الظاهري. علينا أن نظهر هذه البروتوكولات تستخدم ك. xylinus، ومع ذلك، يمكن تكييف هذه البروتوكولات لدراسة استجابة الاثيلين في غيرها من البكتيريا باستخدام متوسط النمو المناسب وتحليل النمط الظاهري.
Protocol
Representative Results
Discussion
الأساليب المذكورة هنا تلخص في الإنتاج الموقعي من الاثيلين من CEPA لدراسة استجابة الاثيلين البكتيرية باستخدام كائن نموذج، K. xylinus. هذه الطريقة مفيدة جدا كما الاثيلين يمكن أن تنتج من خلال استكمال أي وسط مائي يحتوي على الأس الهيدروجيني أكبر من 3.5 10،11 م?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Dario Bonetta for providing Arabidopsis thaliana seeds and for technical assistance in regards to the triple response assay, as well as Simone Quaranta for help with FT-IR. This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (NSERC-DG) to JLS, an Ontario Graduate Scholarship (OGS) to RVA, and a Queen Elizabeth II Graduate Scholarship in Science and Technology (QEII-GSST) to AJV.
Materials
| 1-aminocyclopropane carboxylic acid (ACC) | Sigma | A3903 | Biosynthetic precursor of ethylene in plants |
| 4-sector Petri dish | Phoenix Biomedical | CA73370-022 | For testing triple response |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | To solidify medium |
| Canon Rebel T1i DLSR camera | Canon | 3818B004 | For pictures of pellicles |
| Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 | Sigma | C2730 | Aqueous solution |
| Citric acid | BioShop | CIT002.500 | For SH medium |
| Commercial bleach | Life Brand | 57800861874 | Bleach for seed sterilization |
| Concentrated HCl | BioShop | HCL666.500 | Hydrochloric acid for pH adjustment |
| Digital USB microscope | Plugable | N/A | For pictures of colonies |
| Ethephon (≥ 96%; 2-chloroethylphosphonic acid) | Sigma | C0143 | Ethylene-releasing compound |
| Glucose | BioBasic | GB0219 | For SH medium |
| Komagataeibacter xylinus ATCC 53582 | ATCC | 53582 | Bacterial cellulose-producing alphaproteobacterium |
| Microcentrifuge tube | LifeGene | LMCT1.7B | 1.7 mL microcentrifuge tube |
| Murashige and Skoog (MS) basal medium | Sigma | M5519 | Arabidopsis thaliana growth medium |
| Na2HPO4·7H2O | BioShop | SPD579.500 | Sodium phosphate, dibasic heptahydrate for SH medium |
| NaCl | BioBasic | SOD001.1 | Sodium chloride for saline and control solution |
| NaH2PO4·H2O | BioShop | SPM306.500 | Sodium phosphate, monobasic monohydrate for control solution |
| NaOH | BioShop | SHY700.500 | Sodium hydroxide for pH adjustment |
| Paraffin film | Parafilm | PM996 | For sealing plates and flasks |
| Peptone (bacteriological) | BioShop | PEP403.1 | For SH medium |
| Petroff-Hausser counting chamber | Hausser scientific | 3900 | Bacterial cell counting chamber |
| Polyethersulfone sterilization filter 0.2 µm | VWR | 28145-501 | For sterilizing cellulase |
| Sucrose | BioShop | SUC600.1 | Sucrose for MS medium |
| Yeast extract | BioBasic | G0961 | For SH medium |
References
- Guzmán, P., Ecker, J. R. Exploiting the triple response of Arabidopsis to identify ethylene-related mutants. Plant Cell. 2 (6), 513-523 (1990).
- Bakshi, A., Shemansky, J. M., Chang, C., Binder, B. M. History of research on the plant hormone ethylene. J. Plant Growth Regul. 34 (4), 809-827 (2015).
- Schaller, G. E. Ethylene and the regulation of plant development. BMC Biol. 10 (1), (2012).
- Hua, J., Sakai, H., et al. EIN4 and ERS2 are members of the putative ethylene receptor gene family in Arabidopsis. Plant Cell. 10 (8), 1321-1332 (1998).
- Bleecker, A. B., Estelle, M. A., Somerville, C., Kende, H. Insensitivity to ethylene conferred by a dominant Mutation in Arabidopsis thaliana. Science. 241 (4869), 1086-1089 (1988).
- Hamilton, A. J., Bouzayen, M., Grierson, D. Identification of a tomato gene for the ethylene-forming enzyme by expression in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (16), 7434-7437 (1991).
- Kim, J. Assessment of ethylene removal with Pseudomonas strains. J. Hazard. Mater. 131 (3), 131-136 (2006).
- Kim, H. E., Shitashiro, M., Kuroda, A., Takiguchi, N., Kato, J. Ethylene chemotaxis in Pseudomonas aeruginosa and other Pseudomonas species. Microbes Environ. 22 (2), 186-189 (2007).
- Augimeri, R. V., Strap, J. L. The phytohormone ethylene enhances bacterial cellulose production, regulates CRP/FNRKx transcription and causes differential gene expression within the cellulose synthesis operon of Komagataeibacter (Gluconacetobacter) xylinus ATCC 53582. Front. Microbiol. 6, 1459 (2015).
- Zhang, W., Wen, C. K. Preparation of ethylene gas and comparison of ethylene responses induced by ethylene, ACC, and ethephon. Plant Physiol. Biochem. 48 (1), 45-53 (2010).
- Zhang, W., Hu, W., Wen, C. K. Ethylene preparation and its application to physiological experiments. Plant Signal. Behav. 5 (4), 453-457 (2010).
- Warner, H. L., Leopold, A. C. Ethylene evolution from 2-chloroethylphosphonic acid. Plant Physiol. 44 (1), 156-158 (1969).
- Biddle, E., Kerfoot, D. G. S., Kho, Y. H., Russell, K. E. Kinetic studies of the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid in aqueous solution. Plant Physiol. 58 (5), 700-702 (1976).
- Klein, I., Lavee, S., Ben-Tal, Y. Effect of water vapor pressure on the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid. Plant Physiol. 63 (3), 474-477 (1979).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- Schramm, M., Hestrin, S. Factors affecting production of cellulose at the air/liquid interface of a culture of Acetobacter xylinum. J. Gen. Microbiol. 11 (1), 123-129 (1954).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ciolacu, D., Ciolacu, F., Popa, V. I. Amorphous cellulose-structure and characterization. Cellul. Chem. Technol. 45 (1), 13-21 (2011).
