Gebruik makend van de Ethyleen-vrijmakende verbinding, 2-Chloroethylphosphonic zuur, als een instrument om ethyleenreactie in Bacteria Studie
Summary
The protocols outlined herein facilitate the convenient investigation of bacterial ethylene responses by utilizing 2-chloroethylphosphonic acid (CEPA). Ethylene is produced in situ through the decomposition of CEPA in an aqueous bacterial growth medium, circumventing the requirement for pure ethylene gas.
Abstract
Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ripening. Exogenous ethylene applied during early plant development triggers the triple response phenotype; a shorter and thicker hypocotyl with an exaggerated apical hook. Despite the intimate relationship between plants and bacteria, the effect of exogenous ethylene on bacteria has been greatly overlooked. This is partly due to the difficulty of controlling gaseous ethylene within the laboratory without specialized equipment. 2-Chloroethylphosphonic acid (CEPA) is a compound that decomposes into ethylene, chlorine, and phosphate in a 1:1:1:1 molar ratio when dissolved in an aqueous medium of pH 3.5 or greater. Here we describe the use of CEPA to produce in situ ethylene for the investigation of ethylene response in bacteria using the fruit-associated, cellulose-producing bacterium Komagataeibacter xylinus as a model organism. The protocols described herein include both the verification of ethylene production from CEPA via the Arabidopsis thaliana triple response assay and the effects of exogenous ethylene on K. xylinus cellulose production, pellicle properties and colonial morphology. These protocols can be adapted to examine the effect of ethylene on other microbes using appropriate growth media and phenotype analyses. The use of CEPA provides researchers with a simple and efficient alternative to pure ethylene gas for the routine determination of bacterial ethylene response.
Introduction
Het olefine etheen (C 2 H 4) werd ontdekt als een plantenhormoon in 1901 toen het werd vastgesteld dat erwt zaailingen, gekweekt in een laboratorium steenkolengas lampen gebruikt, vertoonde een abnormale morfologie waarbij stengels (hypocotylen) waren korter, dikker en boog zich zijwaarts ten opzichte van de normale erwt zaailingen; een fenotype later aangeduid als de triple respons 1,2. Latere studies toonden aan dat ethyleen een belangrijke plantenhormoon dat talrijke ontwikkelingsprocessen zoals groei, stressrespons, rijping van fruit en senescence 3. Arabidopsis thaliana, modelorganisme voor plantenbiologie onderzoek regelt, werd bestudeerd met betrekking tot de reactie op ethyleen. Verschillende ethyleen reactie mutanten zijn geïsoleerd door het benutten van de triple respons fenotype waargenomen in het donker-volwassen A. thaliana zaailingen in aanwezigheid van etheen 1,4,5. De biosynthetische voorloper voor ethyleen productie in planten is 1-aminocyclopropane carbonzuur (ACC) 6 en wordt vaak gebruikt in de drievoudige respons assay endogene etheenproduktie die leidt naar de drievoudige respons fenotype 1,4,5 verhogen.
Hoewel de ethyleenreactie schaal bestudeerd in planten, is het effect van exogeen ethyleen op bacteriën zeer weinig bestudeerd ondanks de nauwe associatie van bacteriën met planten. Een studie meldde dat bepaalde Pseudomonas stammen kunnen overleven met behulp van ethyleen als enige bron van koolstof en energie 7. Echter slechts twee studies aangetoond dat de bacteriën reageren op ethyleen. De eerste studie toonde aan dat stammen van Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, P. putida en P. syringae waren chemotactische richting van ethyleen met gebruik van agarose plug assay waarin gesmolten agarose werd gemengd met een chemotaxis buffer geëquilibreerd met zuiver ethyleengas 8. Echter, voor zover ons bekend, zijn er geen furth geweester rapporten met behulp van zuiver ethyleengas om bacteriële ethyleen reactie, waarschijnlijk te karakteriseren als gevolg van de moeilijkheid van de behandeling van gassen in het laboratorium zonder gespecialiseerde apparatuur. Het tweede rapport van bacteriële ethyleen reactie aangetoond dat ethyleen verhoogde bacteriële cellulose productie en beïnvloed genexpressie in de fruit-geassocieerde bacterie, Komagataeibacter (voorheen Gluconacetobacter) xylinus 9. In dit geval, de ethyleen vrijmakende verbinding, 2-chloroethylphosphonic acid (CEPA) werd gebruikt om ethyleen in situ te produceren binnen het bacteriële groeimedium, het omzeilen van de behoefte aan zuivere ethyleengas of gespecialiseerde apparatuur.
CEPA ethyleengas in een 1: 1 molaire verhouding boven pH 3,5 10,11 via een base gekatalyseerde eerste orde reactie 12-14. De afbraak van CEPA is positief gecorreleerd met pH en temperatuur 13,14 en resulteert in de productie van ethylalcoholeen, chloride en fosfaat. CEPA biedt onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van bacteriële reacties op ethyleen met een handig alternatief voor gasvormige ethyleen.
Het algemene doel van de volgende protocollen wordt een eenvoudige en efficiënte werkwijze voor bacteriële ethyleenreactie bestuderen en inclusief validering van fysiologisch relevante niveaus etheenproductiefaciliteiten van CEPA decompositie in bacteriële groeimedium analyse cultuur pH te waarborgen CEPA ontleding, niet verminderd tijdens de groei van bacteriën, en de evaluatie van het effect van ethyleen op de bacteriële morfologie en fenotype. We laten deze protocollen het gebruik van K. xylinus echter deze protocollen kunnen worden aangepast ethyleenrespons bij andere bacteriën bestuderen door het geschikte groeimedium en fenotype analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven werkwijzen beschrijven de in situ bereiding van ethyleen uit CEPA voor de studie van bacteriële ethyleenreactie met het modelorganisme, K. xylinus. Deze werkwijze is zeer nuttig als ethyleen kan worden verkregen door aanvulling elk waterig medium dat een pH heeft hoger dan 3,5 10,11 met CEPA ontkennen de noodzaak van zuivere ethyleengas of gespecialiseerde laboratoriumapparatuur. Deze methode is niet beperkt tot het bestuderen van de effecten van CEPA afgeleide etheen bac…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Dario Bonetta for providing Arabidopsis thaliana seeds and for technical assistance in regards to the triple response assay, as well as Simone Quaranta for help with FT-IR. This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (NSERC-DG) to JLS, an Ontario Graduate Scholarship (OGS) to RVA, and a Queen Elizabeth II Graduate Scholarship in Science and Technology (QEII-GSST) to AJV.
Materials
| 1-aminocyclopropane carboxylic acid (ACC) | Sigma | A3903 | Biosynthetic precursor of ethylene in plants |
| 4-sector Petri dish | Phoenix Biomedical | CA73370-022 | For testing triple response |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | To solidify medium |
| Canon Rebel T1i DLSR camera | Canon | 3818B004 | For pictures of pellicles |
| Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 | Sigma | C2730 | Aqueous solution |
| Citric acid | BioShop | CIT002.500 | For SH medium |
| Commercial bleach | Life Brand | 57800861874 | Bleach for seed sterilization |
| Concentrated HCl | BioShop | HCL666.500 | Hydrochloric acid for pH adjustment |
| Digital USB microscope | Plugable | N/A | For pictures of colonies |
| Ethephon (≥ 96%; 2-chloroethylphosphonic acid) | Sigma | C0143 | Ethylene-releasing compound |
| Glucose | BioBasic | GB0219 | For SH medium |
| Komagataeibacter xylinus ATCC 53582 | ATCC | 53582 | Bacterial cellulose-producing alphaproteobacterium |
| Microcentrifuge tube | LifeGene | LMCT1.7B | 1.7 mL microcentrifuge tube |
| Murashige and Skoog (MS) basal medium | Sigma | M5519 | Arabidopsis thaliana growth medium |
| Na2HPO4·7H2O | BioShop | SPD579.500 | Sodium phosphate, dibasic heptahydrate for SH medium |
| NaCl | BioBasic | SOD001.1 | Sodium chloride for saline and control solution |
| NaH2PO4·H2O | BioShop | SPM306.500 | Sodium phosphate, monobasic monohydrate for control solution |
| NaOH | BioShop | SHY700.500 | Sodium hydroxide for pH adjustment |
| Paraffin film | Parafilm | PM996 | For sealing plates and flasks |
| Peptone (bacteriological) | BioShop | PEP403.1 | For SH medium |
| Petroff-Hausser counting chamber | Hausser scientific | 3900 | Bacterial cell counting chamber |
| Polyethersulfone sterilization filter 0.2 µm | VWR | 28145-501 | For sterilizing cellulase |
| Sucrose | BioShop | SUC600.1 | Sucrose for MS medium |
| Yeast extract | BioBasic | G0961 | For SH medium |
References
- Guzmán, P., Ecker, J. R. Exploiting the triple response of Arabidopsis to identify ethylene-related mutants. Plant Cell. 2 (6), 513-523 (1990).
- Bakshi, A., Shemansky, J. M., Chang, C., Binder, B. M. History of research on the plant hormone ethylene. J. Plant Growth Regul. 34 (4), 809-827 (2015).
- Schaller, G. E. Ethylene and the regulation of plant development. BMC Biol. 10 (1), (2012).
- Hua, J., Sakai, H., et al. EIN4 and ERS2 are members of the putative ethylene receptor gene family in Arabidopsis. Plant Cell. 10 (8), 1321-1332 (1998).
- Bleecker, A. B., Estelle, M. A., Somerville, C., Kende, H. Insensitivity to ethylene conferred by a dominant Mutation in Arabidopsis thaliana. Science. 241 (4869), 1086-1089 (1988).
- Hamilton, A. J., Bouzayen, M., Grierson, D. Identification of a tomato gene for the ethylene-forming enzyme by expression in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (16), 7434-7437 (1991).
- Kim, J. Assessment of ethylene removal with Pseudomonas strains. J. Hazard. Mater. 131 (3), 131-136 (2006).
- Kim, H. E., Shitashiro, M., Kuroda, A., Takiguchi, N., Kato, J. Ethylene chemotaxis in Pseudomonas aeruginosa and other Pseudomonas species. Microbes Environ. 22 (2), 186-189 (2007).
- Augimeri, R. V., Strap, J. L. The phytohormone ethylene enhances bacterial cellulose production, regulates CRP/FNRKx transcription and causes differential gene expression within the cellulose synthesis operon of Komagataeibacter (Gluconacetobacter) xylinus ATCC 53582. Front. Microbiol. 6, 1459 (2015).
- Zhang, W., Wen, C. K. Preparation of ethylene gas and comparison of ethylene responses induced by ethylene, ACC, and ethephon. Plant Physiol. Biochem. 48 (1), 45-53 (2010).
- Zhang, W., Hu, W., Wen, C. K. Ethylene preparation and its application to physiological experiments. Plant Signal. Behav. 5 (4), 453-457 (2010).
- Warner, H. L., Leopold, A. C. Ethylene evolution from 2-chloroethylphosphonic acid. Plant Physiol. 44 (1), 156-158 (1969).
- Biddle, E., Kerfoot, D. G. S., Kho, Y. H., Russell, K. E. Kinetic studies of the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid in aqueous solution. Plant Physiol. 58 (5), 700-702 (1976).
- Klein, I., Lavee, S., Ben-Tal, Y. Effect of water vapor pressure on the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid. Plant Physiol. 63 (3), 474-477 (1979).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- Schramm, M., Hestrin, S. Factors affecting production of cellulose at the air/liquid interface of a culture of Acetobacter xylinum. J. Gen. Microbiol. 11 (1), 123-129 (1954).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ciolacu, D., Ciolacu, F., Popa, V. I. Amorphous cellulose-structure and characterization. Cellul. Chem. Technol. 45 (1), 13-21 (2011).
