Unter Verwendung der Ethylen-freisetzenden Verbindung, 2-Chlorethylphosphonsäure, als Werkzeug Ethylen-Antwort in Bakterien zu studieren
Summary
The protocols outlined herein facilitate the convenient investigation of bacterial ethylene responses by utilizing 2-chloroethylphosphonic acid (CEPA). Ethylene is produced in situ through the decomposition of CEPA in an aqueous bacterial growth medium, circumventing the requirement for pure ethylene gas.
Abstract
Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ripening. Exogenous ethylene applied during early plant development triggers the triple response phenotype; a shorter and thicker hypocotyl with an exaggerated apical hook. Despite the intimate relationship between plants and bacteria, the effect of exogenous ethylene on bacteria has been greatly overlooked. This is partly due to the difficulty of controlling gaseous ethylene within the laboratory without specialized equipment. 2-Chloroethylphosphonic acid (CEPA) is a compound that decomposes into ethylene, chlorine, and phosphate in a 1:1:1:1 molar ratio when dissolved in an aqueous medium of pH 3.5 or greater. Here we describe the use of CEPA to produce in situ ethylene for the investigation of ethylene response in bacteria using the fruit-associated, cellulose-producing bacterium Komagataeibacter xylinus as a model organism. The protocols described herein include both the verification of ethylene production from CEPA via the Arabidopsis thaliana triple response assay and the effects of exogenous ethylene on K. xylinus cellulose production, pellicle properties and colonial morphology. These protocols can be adapted to examine the effect of ethylene on other microbes using appropriate growth media and phenotype analyses. The use of CEPA provides researchers with a simple and efficient alternative to pure ethylene gas for the routine determination of bacterial ethylene response.
Introduction
Das Olefin Ethylen (C 2 H 4) wurde zum ersten Mal im Jahre 1901 als Pflanzenhormon entdeckt , wenn es beobachtet wurde , dass Erbsenkeimlinge, in einem Labor gezüchtet , die Kohlegaslampen verwendet, eine abnorme Morphologie zeigten , in denen Stiele (Hypokotylen) waren kürzer, dicker und beugte sich seitwärts im Vergleich zu normalen Erbsenkeimlinge; ein Phänotyp genannt später die dreifache Reaktion 1,2. Nachfolgende Studien zeigten , dass Ethylen ist ein wichtiger Phytohormone , die zahlreiche Entwicklungsprozesse wie Wachstum, Stressreaktion, Fruchtreife und Seneszenz 3. Arabidopsis thaliana, einem Modellorganismus für Pflanzenbiologie Forschung, ist gut untersucht in Bezug auf seine Reaktion auf Ethylen reguliert. Mehrere Ethylen – Antwort – Mutanten sind durch Ausnutzen der dreifache Reaktion Phänotyp beobachtet in dunkel gewachsenen A. isoliert thaliana Keimlinge in Gegenwart von Ethylen 1,4,5. Die Biosynthesevorstufe für die Ethylenproduktion in Pflanzen ist 1-aminocyclopropane Carbonsäure (ACC) 6 und häufig während der dreifachen Reaktion Assay verwendet wird endogenen Ethylenproduktion , die auf den dreifachen Reaktion Phänotyp 1,4,5 führt zu erhöhen.
Obwohl die Ethylen-Antwort in Pflanzen weit untersucht wird, wird die Wirkung der exogenen Ethylen auf Bakterien in beträchtlichem Ausmaß mit Pflanzen trotz der engen Verbindung von Bakterien under. Eine Studie berichtet , daß bestimmte Stämme von Pseudomonas überleben 7 Ethylen als alleinige Quelle für Kohlenstoff und Energie. Jedoch haben nur zwei Studien gezeigt, dass Bakterien an Ethylen reagieren. Die erste Studie zeigte , dass Stämme von Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, P. putida und P. syringae waren chemotaktische zu Ethylen unter Verwendung eines Agarose – Plug – Assay , in dem geschmolzene Agarose mit einem Chemotaxis – Puffer wurde mit reinem Ethylengas ins Gleichgewicht gebracht 8. Aber unseres Wissens gab es keine furth gewesener Berichte reines Ethylengas unter Verwendung bakterieller Ethylenantwort zu charakterisieren, wahrscheinlich aufgrund der schwer von Gasen im Labor ohne spezialisierte Ausrüstung Handhabung. Der zweite Bericht der bakteriellen Ethylen – Antwort gezeigt , dass Ethylen xylinus 9 bakterielle Cellulose – Produktion und beeinflusst die Genexpression in der Frucht-assoziierten Bakterium, Komagataeibacter (früher Gluconacetobacter) erhöht. In diesem Fall wurde der Ethylen freisetzenden Verbindung, 2-Chlorethylphosphonsäure (CEPA) verwendete Ethylen in situ innerhalb der Bakterienwachstumsmedium zu erzeugen, wodurch die Notwendigkeit für reines Ethylengas oder spezialisierte Ausrüstung umgeht.
CEPA produziert Ethylen bei einer 1: 1 – Molverhältnis oberhalb von pH 3,5 10,11 durch eine basenkatalysierte, Reaktion erster Ordnung 12 bis 14. Der Abbau von CEPA positiv mit pH und Temperatur 13,14 und Ergebnisse bei der Herstellung von Ethyl korreliertenene, Chlorid und Phosphat. CEPA bietet Forscher interessiert sich für bakterielle Reaktionen auf Ethylen mit einer günstigen Alternative zu gasförmigem Ethylen zu studieren.
Das übergeordnete Ziel der folgenden Protokolle ist es, ein einfaches und effizientes Verfahren zur Verfügung zu stellen bakterielle Ethylenantwort zu untersuchen und umfasst Validierung von physiologisch relevanten Niveaus der Ethylenproduktion von CEPA Zersetzung in Bakterienwachstumsmedium, Analyse der Kultur pH sicherzustellen CEPA Zersetzung nicht beeinträchtigt wird während Bakterienwachstum, und die Beurteilung der Wirkung von Ethylen auf bakterielle Morphologie und Phänotyp. Wir zeigen diese Protokolle K. mit xylinus, jedoch können diese Protokolle angepasst werden Ethylenantwort in anderen Bakterien zu untersuchen , indem die geeigneten Wachstumsmedium und Phänotyp – Analysen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebenen Methoden skizzieren die de – situ – Herstellung von Ethylen aus CEPA für die Untersuchung von bakteriellen Ethylenantwort des Modellorganismus, K. xylinus. Dieses Verfahren ist sehr geeignet als Ethylen können durch Ergänzung beliebigen wässrigen Medium hergestellt werden, die einen pH – Wert größer als 3,5 10,11 mit CEPA negiert die Notwendigkeit für reines Ethylengas oder spezielle Laborausrüstung hat. Dieses Verfahren ist auf die Untersuchung der Wi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Dario Bonetta for providing Arabidopsis thaliana seeds and for technical assistance in regards to the triple response assay, as well as Simone Quaranta for help with FT-IR. This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (NSERC-DG) to JLS, an Ontario Graduate Scholarship (OGS) to RVA, and a Queen Elizabeth II Graduate Scholarship in Science and Technology (QEII-GSST) to AJV.
Materials
| 1-aminocyclopropane carboxylic acid (ACC) | Sigma | A3903 | Biosynthetic precursor of ethylene in plants |
| 4-sector Petri dish | Phoenix Biomedical | CA73370-022 | For testing triple response |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | To solidify medium |
| Canon Rebel T1i DLSR camera | Canon | 3818B004 | For pictures of pellicles |
| Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 | Sigma | C2730 | Aqueous solution |
| Citric acid | BioShop | CIT002.500 | For SH medium |
| Commercial bleach | Life Brand | 57800861874 | Bleach for seed sterilization |
| Concentrated HCl | BioShop | HCL666.500 | Hydrochloric acid for pH adjustment |
| Digital USB microscope | Plugable | N/A | For pictures of colonies |
| Ethephon (≥ 96%; 2-chloroethylphosphonic acid) | Sigma | C0143 | Ethylene-releasing compound |
| Glucose | BioBasic | GB0219 | For SH medium |
| Komagataeibacter xylinus ATCC 53582 | ATCC | 53582 | Bacterial cellulose-producing alphaproteobacterium |
| Microcentrifuge tube | LifeGene | LMCT1.7B | 1.7 mL microcentrifuge tube |
| Murashige and Skoog (MS) basal medium | Sigma | M5519 | Arabidopsis thaliana growth medium |
| Na2HPO4·7H2O | BioShop | SPD579.500 | Sodium phosphate, dibasic heptahydrate for SH medium |
| NaCl | BioBasic | SOD001.1 | Sodium chloride for saline and control solution |
| NaH2PO4·H2O | BioShop | SPM306.500 | Sodium phosphate, monobasic monohydrate for control solution |
| NaOH | BioShop | SHY700.500 | Sodium hydroxide for pH adjustment |
| Paraffin film | Parafilm | PM996 | For sealing plates and flasks |
| Peptone (bacteriological) | BioShop | PEP403.1 | For SH medium |
| Petroff-Hausser counting chamber | Hausser scientific | 3900 | Bacterial cell counting chamber |
| Polyethersulfone sterilization filter 0.2 µm | VWR | 28145-501 | For sterilizing cellulase |
| Sucrose | BioShop | SUC600.1 | Sucrose for MS medium |
| Yeast extract | BioBasic | G0961 | For SH medium |
References
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