Используя Этилен-рилизинг-соединение, 2-Chloroethylphosphonic кислота, в качестве инструмента для изучения Этилен ответа бактерий
Summary
The protocols outlined herein facilitate the convenient investigation of bacterial ethylene responses by utilizing 2-chloroethylphosphonic acid (CEPA). Ethylene is produced in situ through the decomposition of CEPA in an aqueous bacterial growth medium, circumventing the requirement for pure ethylene gas.
Abstract
Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ripening. Exogenous ethylene applied during early plant development triggers the triple response phenotype; a shorter and thicker hypocotyl with an exaggerated apical hook. Despite the intimate relationship between plants and bacteria, the effect of exogenous ethylene on bacteria has been greatly overlooked. This is partly due to the difficulty of controlling gaseous ethylene within the laboratory without specialized equipment. 2-Chloroethylphosphonic acid (CEPA) is a compound that decomposes into ethylene, chlorine, and phosphate in a 1:1:1:1 molar ratio when dissolved in an aqueous medium of pH 3.5 or greater. Here we describe the use of CEPA to produce in situ ethylene for the investigation of ethylene response in bacteria using the fruit-associated, cellulose-producing bacterium Komagataeibacter xylinus as a model organism. The protocols described herein include both the verification of ethylene production from CEPA via the Arabidopsis thaliana triple response assay and the effects of exogenous ethylene on K. xylinus cellulose production, pellicle properties and colonial morphology. These protocols can be adapted to examine the effect of ethylene on other microbes using appropriate growth media and phenotype analyses. The use of CEPA provides researchers with a simple and efficient alternative to pure ethylene gas for the routine determination of bacterial ethylene response.
Introduction
Олефин этилена (С 2 Н 4) был впервые обнаружен в качестве гормона растений в 1901 г. , когда было обнаружено , что проростков гороха, выращенных в лаборатории , которые использовали уголь газовых ламп, обнаруживал аномальную морфологию , в которой грозди (гипокотиля) были короче, толще и изгибается в сторону по сравнению с нормальными проростков гороха; фенотип позже назвал тройной 1,2 ответа. Последующие исследования показали , что этилен является жизненно важным фитогормонов , который регулирует многочисленные процессы развития , такие как рост, реакции на стресс, созревание плодов и Старение 3. Резуховидка Таля, модельного организма для исследования биологии растений, хорошо изучен в отношении его реакции на этилен. Мутанты ответа Несколько этилена были выделены за счет использования тройного фенотип ответ , наблюдаемый в темно-выращенной А. thaliana рассады в присутствии этилена 1,4,5. Биосинтетического предшественника для производства этилена в растениях 1-аminocyclopropane карбоновой кислоты (АСС) 6 и обычно используется в процессе анализа тройной ответ , чтобы увеличить выработку эндогенного этилена , что приводит к тройному фенотипа ответ 1,4,5.
Хотя реакция этилена широко изучен в растениях, действие экзогенного этилена на бактерий значительно изучено недостаточно, несмотря на тесной ассоциации бактерий с растениями. В одном из исследований сообщалось , что некоторые штаммы Pseudomonas могут выжить с использованием этилена в качестве единственного источника углерода и энергии 7. Тем не менее, только два исследования показали, что бактерии реагируют на этилен. Первое исследование показало , что штаммы синегнойной палочки, P. Fluorescens, П. putida и P. syringae были хемотаксическая к этилена с использованием агарозы анализа штепсельной вилки , в котором расплавленный агарозы, смешивали с буфером для хемотаксиса , уравновешенную чистым газообразным этиленом 8. Тем не менее, насколько нам известно, не было ни одного Фюртотчеты эр с использованием чистого газообразного этилена для характеристики бактериальной реакции этилена, вероятно, связано с трудноподдающихся обращения газов в лаборатории без специализированного оборудования. Второй доклад бактериальной реакции этилена показали , что этилен увеличился объем производства целлюлозы бактерий и влиял на экспрессию генов в фруктовой-ассоциированной бактерии, Komagataeibacter (ранее Gluconacetobacter) xylinus 9. В этом случае соединение этилен-рилизинг, использовали 2-chloroethylphosphonic кислота (СЕРА) для получения этилена на месте в бактериальной ростовой среде, обходя потребность чистого газообразного этилена или специализированного оборудования.
СЕРА производит этилен при соотношении 1: 1 молярной при рН выше 3,5 10,11 через катализируемой основанием, реакцией первого порядка 12 – 14. Деградация ЗООСК положительно коррелирует с рН и температурой 13,14 и результатов в производстве этилового эфираена, хлорид и фосфат. CEPA обеспечивает исследователей, заинтересованных в изучении бактериальных ответов этилена с удобной альтернативой газообразным этиленом.
Общая цель следующих протоколов является обеспечение простой и эффективный метод для изучения бактериальных ответ этилена и включает в себя проверку физиологически соответствующих уровней производства этилена из разложения CEPA средой роста бактерий, анализ культуры рН, чтобы обеспечить СЕРА разложение не нарушается во время рост бактерий, и оценка влияния этилена на бактериальной морфологии и фенотипом. Мы демонстрируем эти протоколы с использованием К. xylinus, однако, эти протоколы могут быть адаптированы для изучения реакции этилена в других бактерий, используя соответствующую среду для роста и фенотип анализов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методы , описанные здесь , очертить на месте залегания производства этилена из CEPA для исследования бактериальной реакции этилена с использованием модельного организма, К. xylinus. Этот метод очень полезен в качестве этилен может быть получен путем дополнения любой водной среде, ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Dario Bonetta for providing Arabidopsis thaliana seeds and for technical assistance in regards to the triple response assay, as well as Simone Quaranta for help with FT-IR. This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (NSERC-DG) to JLS, an Ontario Graduate Scholarship (OGS) to RVA, and a Queen Elizabeth II Graduate Scholarship in Science and Technology (QEII-GSST) to AJV.
Materials
| 1-aminocyclopropane carboxylic acid (ACC) | Sigma | A3903 | Biosynthetic precursor of ethylene in plants |
| 4-sector Petri dish | Phoenix Biomedical | CA73370-022 | For testing triple response |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | To solidify medium |
| Canon Rebel T1i DLSR camera | Canon | 3818B004 | For pictures of pellicles |
| Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 | Sigma | C2730 | Aqueous solution |
| Citric acid | BioShop | CIT002.500 | For SH medium |
| Commercial bleach | Life Brand | 57800861874 | Bleach for seed sterilization |
| Concentrated HCl | BioShop | HCL666.500 | Hydrochloric acid for pH adjustment |
| Digital USB microscope | Plugable | N/A | For pictures of colonies |
| Ethephon (≥ 96%; 2-chloroethylphosphonic acid) | Sigma | C0143 | Ethylene-releasing compound |
| Glucose | BioBasic | GB0219 | For SH medium |
| Komagataeibacter xylinus ATCC 53582 | ATCC | 53582 | Bacterial cellulose-producing alphaproteobacterium |
| Microcentrifuge tube | LifeGene | LMCT1.7B | 1.7 mL microcentrifuge tube |
| Murashige and Skoog (MS) basal medium | Sigma | M5519 | Arabidopsis thaliana growth medium |
| Na2HPO4·7H2O | BioShop | SPD579.500 | Sodium phosphate, dibasic heptahydrate for SH medium |
| NaCl | BioBasic | SOD001.1 | Sodium chloride for saline and control solution |
| NaH2PO4·H2O | BioShop | SPM306.500 | Sodium phosphate, monobasic monohydrate for control solution |
| NaOH | BioShop | SHY700.500 | Sodium hydroxide for pH adjustment |
| Paraffin film | Parafilm | PM996 | For sealing plates and flasks |
| Peptone (bacteriological) | BioShop | PEP403.1 | For SH medium |
| Petroff-Hausser counting chamber | Hausser scientific | 3900 | Bacterial cell counting chamber |
| Polyethersulfone sterilization filter 0.2 µm | VWR | 28145-501 | For sterilizing cellulase |
| Sucrose | BioShop | SUC600.1 | Sucrose for MS medium |
| Yeast extract | BioBasic | G0961 | For SH medium |
References
- Guzmán, P., Ecker, J. R. Exploiting the triple response of Arabidopsis to identify ethylene-related mutants. Plant Cell. 2 (6), 513-523 (1990).
- Bakshi, A., Shemansky, J. M., Chang, C., Binder, B. M. History of research on the plant hormone ethylene. J. Plant Growth Regul. 34 (4), 809-827 (2015).
- Schaller, G. E. Ethylene and the regulation of plant development. BMC Biol. 10 (1), (2012).
- Hua, J., Sakai, H., et al. EIN4 and ERS2 are members of the putative ethylene receptor gene family in Arabidopsis. Plant Cell. 10 (8), 1321-1332 (1998).
- Bleecker, A. B., Estelle, M. A., Somerville, C., Kende, H. Insensitivity to ethylene conferred by a dominant Mutation in Arabidopsis thaliana. Science. 241 (4869), 1086-1089 (1988).
- Hamilton, A. J., Bouzayen, M., Grierson, D. Identification of a tomato gene for the ethylene-forming enzyme by expression in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (16), 7434-7437 (1991).
- Kim, J. Assessment of ethylene removal with Pseudomonas strains. J. Hazard. Mater. 131 (3), 131-136 (2006).
- Kim, H. E., Shitashiro, M., Kuroda, A., Takiguchi, N., Kato, J. Ethylene chemotaxis in Pseudomonas aeruginosa and other Pseudomonas species. Microbes Environ. 22 (2), 186-189 (2007).
- Augimeri, R. V., Strap, J. L. The phytohormone ethylene enhances bacterial cellulose production, regulates CRP/FNRKx transcription and causes differential gene expression within the cellulose synthesis operon of Komagataeibacter (Gluconacetobacter) xylinus ATCC 53582. Front. Microbiol. 6, 1459 (2015).
- Zhang, W., Wen, C. K. Preparation of ethylene gas and comparison of ethylene responses induced by ethylene, ACC, and ethephon. Plant Physiol. Biochem. 48 (1), 45-53 (2010).
- Zhang, W., Hu, W., Wen, C. K. Ethylene preparation and its application to physiological experiments. Plant Signal. Behav. 5 (4), 453-457 (2010).
- Warner, H. L., Leopold, A. C. Ethylene evolution from 2-chloroethylphosphonic acid. Plant Physiol. 44 (1), 156-158 (1969).
- Biddle, E., Kerfoot, D. G. S., Kho, Y. H., Russell, K. E. Kinetic studies of the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid in aqueous solution. Plant Physiol. 58 (5), 700-702 (1976).
- Klein, I., Lavee, S., Ben-Tal, Y. Effect of water vapor pressure on the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid. Plant Physiol. 63 (3), 474-477 (1979).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- Schramm, M., Hestrin, S. Factors affecting production of cellulose at the air/liquid interface of a culture of Acetobacter xylinum. J. Gen. Microbiol. 11 (1), 123-129 (1954).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ciolacu, D., Ciolacu, F., Popa, V. I. Amorphous cellulose-structure and characterization. Cellul. Chem. Technol. 45 (1), 13-21 (2011).
