LED Thermo Flow - Optogenetics Combinant avec cytométrie de flux
Summary
Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.
Abstract
Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.
Introduction
Outils optogénétiques ont gagné en popularité, en partie parce qu'ils peuvent être utilisés pour déchiffrer le câblage des voies de signalisation 1-4. Ils sont basés sur la capacité des protéines photoactivables pour changer leur conformation et l'affinité de liaison lorsqu'il est éclairé par la lumière. Fusionnant ces protéines à des éléments de signalisation permet la régulation spécifique d'un seul joueur dans complexes voies de signalisation intracellulaires 5-12. Par conséquent, une voie de signalisation peut être étudiée avec une résolution spatiale et temporelle élevée.
La plupart des études basées sur des cellules optogénétiques utilisent des méthodes basées sur la microscopie, combinée à la culture en présence de lumière, suivie par l' analyse biochimique 11,12. En revanche, un flux singularise cytomètre de cellules le long d'un capillaire et mesure la taille de la cellule, la granularité et l'intensité de fluorescence. Cette méthode présente des avantages majeurs sur la microscopie ou biochimiques méthodes, y compris la capacité d'analyser thousands de cellules à une résolution unique cellule vivante dans un temps très court. Par conséquent, il est souhaitable de combiner avec optogénétique cytométrie de flux.
À notre connaissance, il n'y a pas de protocole établi pour cytométrie de flux optogenetic. Une méthode largement acceptée consiste à éclairer manuellement les cellules à l'extérieur du tube de réaction avec des dispositifs d'affichage lumineux. Cependant, l'éclairage manuel du débit nécessite cytomètre la lumière de passer à travers le tube de réaction et, pour l'imagerie des cellules vivantes, une forme cylindrique, chambre d'eau chauffée. Cela provoque la diffusion de lumière importante et la perte de lumière. En outre, l'intensité de la lumière fournie par un éclairage manuel est pas reproductible entre les expériences (angle, distance, etc.) et il y a une limite pratique au nombre de longueurs d'onde dans une expérience.
En construisant le dispositif LED Thermo Flow, nous avons pu surmonter ces limitations. Avec ce dispositif, les cellules peuvent être éclairées par des longueurs d'onde spécifiques dans une températurelit- contrôlée de manière pendant les mesures de cytométrie en flux. Cela permet des quantités précises et reproductibles de la lumière à l'intérieur et entre les expériences.
Pour démontrer l'utilité de notre dispositif in vivo, nous avons enregistré le signal de fluorescence de Dronpa dans les cellules B Ramos pendant photocommutation. les cellules B Ramos sont dérivées d'un lymphome de Burkitt humain. Dronpa est une protéine fluorescente qui existe sous forme d'un monomère, dimère ou un tétramère. Dans sa forme monomère, il est non-fluorescent. Illumination avec 400 nm de lumière induit dimérisation et tétramérisation et rend la protéine fluorescente Dronpa. Ce processus peut être inversé par illumination avec 500 nm de lumière. La protéine Dronpa a été utilisé pour contrôler la fonction et la localisation des protéines de signalisation 4,13.
Ici, nous avons exprimé une protéine Dronpa-Linker-Dronpa dans les cellules B Ramos pour étudier photocommutation de Dronpa dans un cytomètre de flux. En utilisant notre dispositif, nous avons pu efficacement etPHOTOSWITCH reproductible Dronpa lors de l'enregistrement de son intensité de fluorescence en temps réel. Cette méthode offre des avantages substantiels par rapport aux protocoles d'éclairage actuels avec éclairage manuel et élargit considérablement le répertoire expérimental pour les outils optogénétiques et des composés de la cage. Grâce à notre dispositif simplifiera considérablement et d'accélérer la découverte et le développement de nouveaux outils de optogénétiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le Thermo flux LED est un dispositif innovant pour étudier les outils optogénétiques dans un cytomètre de flux.
Jusqu'à présent, les échantillons optogénétiques ont été illuminée seulement avec des lasers de microscopie ou des dispositifs de lampe de poche 11,12. En fonction de l'angle et la distance de la lampe torche à l'échantillon, la variabilité importante de la quantité d'éclairement est prévu entre les expériences. En outre, il y a une lim…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank J. Schmidt from the University of Freiburg for constructing the device. We thank P. Nielsen and D. Medgyesi for their support and critical reading of this manuscript. This study was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft through SFB746 and by the Excellence Initiative of the German Research Foundation (GSC-4, Spemann Graduate School).
Materials
| Glass FACS tube | Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA | 14-961-26 | Borosilicate glass tubes 12×75 mm |
| Flow Cytometer | BD Bioscienceg; Heidelberg, Germany | Fortessa II | Special Order |
| Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N | Addgene; Cambridge, USA | 41645 | |
| PolyJet | SignaGen, Rockville, USA | SL100688 | |
| LED 505 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | HLMP-CE34-Y1CDD | |
| LED 400 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | UV5TZ-400-15 | |
| Plexiglas tube 15 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 76999 | |
| Plexiglas 3 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692230 | |
| Plexiglas 2,5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692225 | |
| Plexiglas 1,5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692215 | |
| PVC tile 5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.005 | |
| PVC tile 6 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.006 | |
| PVC block 50 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.050 | |
| RPMI | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
| 2-Mercaptoethanol | EMD; Germany | 805740 | |
| FCS | PAN Biotech; Aidenbach, Germany | P30-3302 | |
| Penicillin/Strptomycin (10000 U/ml) | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 15140-122 | |
| Acrifix plexiglas glue | Evonic industries, Essen, Germany | 1R0192 | |
| Tangit PVC-U glue | Henkel, Düsseldorf, Germany |
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