LED Thermo Flow - Die Kombination mit Optogenetik Flow Cytometry
Summary
Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.
Abstract
Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.
Introduction
Optogenetische Werkzeuge wurden an Popularität gewinnt, zum Teil , weil sie verwendet werden können , die Verdrahtung von Signal 1-4 Wege zu entziffern. Sie basieren auf der Fähigkeit von photoaktivierbaren Proteine anhand ihrer Konformation und Bindungsaffinität zu ändern, wenn sie mit Licht bestrahlt. Fusing diese Proteine Signalelemente ermöglicht die spezielle Regelung eines einzelnen Spielers in komplexen intrazellulären Signalwege 5-12. Folglich kann ein Signalweg mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung untersucht werden.
Die meisten zellbasierten optogenetische Studien verwenden Mikroskopie-basierten Methoden mit Kultivierungs kombiniert in Gegenwart von Licht, 11,12 durch biochemische Analyse verfolgt. Im Gegensatz dazu Zytometer ein Fluss singularizes Zellen entlang einer Kapillare und misst Zellgröße, Granularität und Fluoreszenzintensitäten. Dieses Verfahren hat wesentliche Vorteile gegenüber der Mikroskopie oder biochemische Methoden, einschließlich der Fähigkeit zu analysieren thousands von Zellen bei Single-Cell-Auflösung in einer sehr kurzen Zeit zu leben. Daher ist es wünschenswert Optogenetik mit Durchflusszytometrie zu kombinieren.
Unseres Wissens gibt es kein anerkanntes Protokoll für optogenetische Durchflusszytometrie. Ein breit akzeptiertes Verfahren ist die manuelle Zellen von außerhalb des Reaktionsrohres mit Taschenlampe Geräte beleuchten. Allerdings erfordert eine manuelle Beleuchtung im Durchflusszytometer das Licht durch das Reaktionsrohr zu passieren, und für Live Cell Imaging, eine zylindrische, beheizte Wasserkammer. Dies führt zu einer wesentlichen Lichtstreuung und Lichtverlust. Außerdem ist die Lichtintensität durch manuelle Beleuchtung vorgesehen nicht reproduzierbar zwischen den Experimenten (Winkel, Abstand, etc.) und es gibt eine praktische Grenze für die Anzahl von Wellenlängen in einem Experiment.
die LED-Thermo Flow-Gerät Durch die Konstruktion, wir waren in der Lage, diese Einschränkungen zu überwinden. Mit diesem Gerät können die Zellen mit spezifischen Wellenlängen in einem temporären beleuchtbareratur gesteuert während der Messungen durchflusszytometrischen. Dies ermöglicht eine präzise und reproduzierbare Lichtmengen innerhalb und zwischen den Experimenten.
Um die Nützlichkeit unseres Gerätes in vivo zeigen, nahmen wir das Fluoreszenzsignal von Dronpa in Ramos B – Zellen während der Photoschalten . Ramos-B-Zellen von einem humanen Burkitt-Lymphom abgeleitet. Dronpa ein fluoreszierendes Protein, das als ein Monomer, Dimer oder Tetramer vorliegt. In seiner monomeren Form ist es nicht fluoreszierend. Beleuchtung mit 400 nm-Licht induziert die Dimerisierung und Tetramerisierung und macht das Dronpa Protein fluoreszierend. Dieser Prozess kann durch Beleuchtung mit Licht von 500 nm umgekehrt werden. Das Dronpa Protein verwendet worden ist, die Funktion und Position zu steuern Signalproteinen 4,13.
Hier ausgedrückt wir eine Dronpa-Linker-Dronpa Protein in Ramos-B-Zellen Photoschaltbarkeit von Dronpa in einem Durchflusszytometer zu studieren. Mit unserem Gerät waren wir in der Lage, effizient undreproduzierbar Photoschalter Dronpa während in Echtzeit die Aufnahme seiner Fluoreszenzintensität. Dieses Verfahren bietet wesentliche Vorteile gegenüber aktuellen Beleuchtungs Protokolle mit manueller Beleuchtung und erweitert signifikant das experimentelle Repertoire für optogenetische Werkzeuge und Käfigverbindungen. Mit unserem Gerät die Entdeckung und Entwicklung von neuartigen optogenetische Werkzeuge erheblich vereinfachen und beschleunigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die LED Thermo Flow ist ein innovatives Gerät optogenetische Werkzeuge in einem Durchflusszytometer zu studieren.
Bisher optogenetische Proben nur 11,12 mit Mikroskopie Laser oder Taschenlampe Geräte beleuchtet worden. Je nach Winkel und Abstand der Lampe zur Probe, erhebliche Variabilität in der Menge des Beleuchtungs zwischen Experimenten erwartet. Darüber hinaus gibt es eine Grenze für die Anzahl von Taschenlampen eine einzelne Person in einem Experiment arbeiten kann. Die…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank J. Schmidt from the University of Freiburg for constructing the device. We thank P. Nielsen and D. Medgyesi for their support and critical reading of this manuscript. This study was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft through SFB746 and by the Excellence Initiative of the German Research Foundation (GSC-4, Spemann Graduate School).
Materials
| Glass FACS tube | Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA | 14-961-26 | Borosilicate glass tubes 12×75 mm |
| Flow Cytometer | BD Bioscienceg; Heidelberg, Germany | Fortessa II | Special Order |
| Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N | Addgene; Cambridge, USA | 41645 | |
| PolyJet | SignaGen, Rockville, USA | SL100688 | |
| LED 505 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | HLMP-CE34-Y1CDD | |
| LED 400 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | UV5TZ-400-15 | |
| Plexiglas tube 15 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 76999 | |
| Plexiglas 3 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692230 | |
| Plexiglas 2,5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692225 | |
| Plexiglas 1,5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692215 | |
| PVC tile 5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.005 | |
| PVC tile 6 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.006 | |
| PVC block 50 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.050 | |
| RPMI | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
| 2-Mercaptoethanol | EMD; Germany | 805740 | |
| FCS | PAN Biotech; Aidenbach, Germany | P30-3302 | |
| Penicillin/Strptomycin (10000 U/ml) | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 15140-122 | |
| Acrifix plexiglas glue | Evonic industries, Essen, Germany | 1R0192 | |
| Tangit PVC-U glue | Henkel, Düsseldorf, Germany |
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