Thermo flusso LED - La combinazione Optogenetics con citometria a flusso
Summary
Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.
Abstract
Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.
Introduction
Strumenti optogenetic stanno guadagnando popolarità, in parte perché possono essere utilizzati per decifrare il cablaggio delle vie di segnalazione 1-4. Essi si basano sulla capacità delle proteine fotoattivabile di cambiare la loro conformazione e affinità di legame quando illuminato con luce. Fondendo queste proteine ad elementi di segnalazione consente la normativa specifica di un singolo giocatore all'interno di complesse vie di segnalazione intracellulare 5-12. Di conseguenza, un percorso di segnalazione può essere studiato con alta risoluzione temporale e spaziale.
La maggior parte degli studi optogenetic basati su celle utilizzano metodi di microscopia a base combinati con coltura in presenza di luce, seguita da analisi biochimiche 11,12. Al contrario, un flusso singolarizza citometro celle lungo un capillare e misura la dimensione della cella, granularità e intensità di fluorescenza. Questo metodo ha importanti vantaggi rispetto microscopia o biochimici metodi, tra cui la capacità di analizzare thousands di cellule alla risoluzione di una singola cellula vivente in un tempo molto breve. Quindi, è desiderabile combinare optogenetics con citometria di flusso.
A nostra conoscenza, non vi è alcun protocollo stabilito per citometria a flusso optogenetic. Una procedura largamente accettata è di illuminare manualmente le cellule da fuori tubo di reazione con i dispositivi torcia elettrica. Tuttavia, illuminazione manuale nel flusso richiede citometro alla luce di passare attraverso il tubo di reazione e, per l'imaging cellulare dal vivo, cilindrica, camera di acqua riscaldata. Ciò causa sostanziale dispersione della luce e la perdita di luce. Inoltre, l'intensità della luce fornita da illuminazione manuale non è riproducibile tra esperimenti (angolo, distanza, ecc) e vi è un limite pratico al numero di lunghezze d'onda in un esperimento.
Con la costruzione del dispositivo Thermo flusso LED, siamo stati in grado di superare questi limiti. Con questo dispositivo, le cellule possono essere illuminati con specifiche lunghezze d'onda in una temperaturaerature controllato modo durante le misure di citometria a flusso. Questo permette di quantità precise e riproducibili di luce all'interno e tra esperimenti.
Per dimostrare l'utilità del nostro dispositivo in vivo, abbiamo registrato il segnale di fluorescenza di Dronpa nelle cellule Ramos B durante photoswitching. le cellule Ramos B sono derivati da un linfoma di Burkitt umana. Dronpa è una proteina fluorescente che esiste come monomero, dimero o tetramero. Nella sua forma monomerica, è non fluorescente. Illuminazione con 400 nm luce induce dimerizzazione e tetramerizzazione e rende fluorescente proteina Dronpa. Questo processo può essere invertito illuminazione con 500 luce nm. La proteina Dronpa è stato usato per controllare la funzione e la posizione di segnalazione proteine 4,13.
Qui, abbiamo espresso una proteina Dronpa-Linker-Dronpa nelle cellule Ramos B per studiare photoswitching di Dronpa in un citofluorimetro. Utilizzando il nostro dispositivo, siamo stati in grado di efficienza eFOTOINTERRUTTORE riproducibile Dronpa durante la registrazione la sua intensità di fluorescenza in tempo reale. Questo metodo fornisce vantaggi sostanziali rispetto protocolli illuminazione attuale con illuminazione manuale e amplia notevolmente il repertorio sperimentale per strumenti optogenetic e composti gabbia. Utilizzando il nostro dispositivo semplificherà e accelerare la scoperta e lo sviluppo di strumenti innovativi optogenetic in modo significativo.
Protocol
Representative Results
Discussion
La Thermo flusso LED è un dispositivo innovativo per studiare strumenti optogenetic in un citometro di flusso.
Finora, i campioni sono stati optogenetic illuminata solo con i laser microscopia o dispositivi torcia elettrica 11,12. A seconda dell'angolo e della distanza della torcia al campione, sostanziale variabilità nella quantità di illuminazione è previsto tra esperimenti. Inoltre, vi è un limite al numero di torce una singola persona può operare in un esperimento. Q…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank J. Schmidt from the University of Freiburg for constructing the device. We thank P. Nielsen and D. Medgyesi for their support and critical reading of this manuscript. This study was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft through SFB746 and by the Excellence Initiative of the German Research Foundation (GSC-4, Spemann Graduate School).
Materials
| Glass FACS tube | Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA | 14-961-26 | Borosilicate glass tubes 12×75 mm |
| Flow Cytometer | BD Bioscienceg; Heidelberg, Germany | Fortessa II | Special Order |
| Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N | Addgene; Cambridge, USA | 41645 | |
| PolyJet | SignaGen, Rockville, USA | SL100688 | |
| LED 505 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | HLMP-CE34-Y1CDD | |
| LED 400 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | UV5TZ-400-15 | |
| Plexiglas tube 15 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 76999 | |
| Plexiglas 3 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692230 | |
| Plexiglas 2,5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692225 | |
| Plexiglas 1,5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692215 | |
| PVC tile 5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.005 | |
| PVC tile 6 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.006 | |
| PVC block 50 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.050 | |
| RPMI | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
| 2-Mercaptoethanol | EMD; Germany | 805740 | |
| FCS | PAN Biotech; Aidenbach, Germany | P30-3302 | |
| Penicillin/Strptomycin (10000 U/ml) | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 15140-122 | |
| Acrifix plexiglas glue | Evonic industries, Essen, Germany | 1R0192 | |
| Tangit PVC-U glue | Henkel, Düsseldorf, Germany |
References
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