détection de la Trypanosoma brucei Switching Variant de glycoprotéine de surface par magnétique tri cellulaire activé et cytométrie de flux

Summary

Les trypanosomes africains cultivés in vitro subissent une variation antigénique à un faible taux, de sorte que les populations sont constituées de parasites exprimant un variant dominant de type glycoprotéine de surface (VSG) et d’une petite population de variants « commutés ». Ce protocole décrit une méthode rapide de détection et de quantification de ces populations.

Abstract

Trypanosoma brucei, un parasite protozoaire qui provoque à la fois la trypanosomiase africaine humaine et animale (connue sous le nom de maladie du sommeil et de nagana, respectivement) circule entre un vecteur de tsé-tsé et un hôte mammifère. Il échappe au système immunitaire de l’hôte mammifère en changeant périodiquement la glycoprotéine de surface dense et variante (VSG) qui recouvre sa surface. La détection de la variation antigénique chez Trypanosoma brucei peut être à la fois lourde et laborieuse. Ici, nous présentons une méthode pour quantifier le nombre de parasites qui ont « changé » pour exprimer une nouvelle VSG dans une population donnée. Les parasites sont d’abord colorés avec un anticorps contre le VSG de départ, puis colorés avec un anticorps secondaire attaché à une bille magnétique. Les parasites exprimant la VSG de départ sont ensuite séparés du reste de la population en faisant passer les parasites sur une colonne attachée à un aimant. Les parasites exprimant la VSG dominante et initiale sont conservés sur la colonne, tandis que la circulation contient des parasites qui expriment une nouvelle VSG ainsi que certains contaminants exprimant la VSG de départ. Cette population est à nouveau colorée avec un anticorps marqué par fluorescence contre le VSG de départ pour marquer les contaminants, et de l’iodure de propidium (PI), qui marque les cellules mortes. Un nombre connu de billes de comptage absolu visibles par cytométrie en flux est ajouté à la population à flux continu. Le rapport entre les billes et le nombre de cellules collectées peut ensuite être utilisé pour extrapoler le nombre de cellules dans l’échantillon entier. La cytométrie en flux est utilisée pour quantifier la population de commutateurs en comptant le nombre de cellules PI négatives qui ne se colorent pas positivement pour le VSG dominant de départ. La proportion de commutateurs dans la population peut ensuite être calculée à l’aide des données de cytométrie en flux.

Introduction

Le parasite protozoaire, Trypanosoma brucei, est un agent causal de maladies qui affectent les humains (via Trypanosoma brucei gambiense et Trypanosoma brucei rhodesiense) et les animaux (via Trypanosoma brucei brucei) dans toute l' Afrique sub-saharienne. Elle est transmise à l'hôte de mammifère par la salive du vecteur de la mouche tsé-tsé. Les deux humains et de la trypanosomiase animale africaine causent un fardeau économique sévère dans les régions endémiques, et peu de médicaments sont disponibles ou en développement pour traiter soit la maladie. mécanismes d'évasion immunitaire Comprendre est critique pour le développemen....

Protocol

NOTE: Tout au long de la procédure, il est nécessaire de garder les cellules sur la glace. les médias froids doivent également être utilisés tout au long.

1. Récolte de l'échantillon

1. Cultivez Lister 427 trypanosomes souche de la circulation sanguine à une densité de 0,5 - 1 million / ml. Il est préférable de commencer les cultures avec un petit nombre de parasites. Isoler 50 x 10 ⁶ cellules / échantillon pendant 10 min à 1500 x g. Assurez - vous de laisser 1 x 10 ⁶ cellules en culture pour une utilisation ultérieure des contrôles d' anticorps positifs et négatifs.
   NOTE: Ce protocole peut éga....

Results

La méthode décrite ici a été utilisé pour démontrer que les cassures double brin dans le site d'expression de VSG augmenté le nombre de switchers dans une population ^8. Ici, nous montrons des résultats représentatifs d'une population de trypanosomes qui ont été induites de manière similaire pour générer une cassure double brin au niveau du site d'expression. Nous comparons ces trypanosomes à ceux qui ne l' ont pas été amené à générer une cassure double brin. La figure .......

Discussion

En ce qui concerne la technique expérimentale, le composant le plus critique du protocole est de garder tous les échantillons froids. Les trypanosomes intérioriser très rapidement anticorps lié à leur surface ^9, mais ce processus dépend de la motilité, et n'a pas d' influence l'essai aussi longtemps que les cellules sont maintenues à 4 ° C. Tous les échantillons doivent toujours être sur la glace, et pipetage devraient être effectués rapidement pour minimiser l'exposition à l'environnement.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
anticorps anti-VSG non marqué	n/a n	/a	L’anticorps VSG est fabriqué en maison
fluorophore Anticorps anti-VSG marqué	n/a	n/a l’anticorps	VSG est fabriqué en maison
HMI-9 support n	/a	n/a	HMI-9 est fabriqué en interne
Propidium Iodide	BD Pharmingen	556463
CountBright billes de comptage absolu	Thermofisher Scientific	C36950
LD colonnes	Miltenyi Biotech	130-042-901
Aimant MACS	Miltenyi Biotech	130-042-303
Séparateur magnétique MACS	Miltenyi Biotech	130-042-302
adaptateur vortex-60	ThermoFisher scientific	AM10014
cytomètre en flux	Coulter	n/a
logiciel d’analyse de cytomètre en flux	FloJo	n/a