påvisning av<em> Trypanosoma brucei</em> Variant Surface glykoprotein Bytte av Magnetic Aktivert Cell Sorting og flowcytometri

Summary

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of “switched” variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

Abstract

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have ‘switched’ to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Introduction

Den protozo parasitt, Trypanosoma brucei, er en utløsende agent for sykdommer som påvirker mennesker (via Trypanosoma brucei gambiense og Trypanosoma brucei rhodesiense) og dyr (via Trypanosoma brucei brucei) i hele Afrika sør for Sahara. Det er overført til pattedyrverts gjennom spytt av Tsetsefluer vektoren. Både mennesker og dyr sovesyke forårsake en alvorlig økonomisk byrde i endemiske områder, og noen stoffer er tilgjengelig eller under utvikling for behandling av enten sykdom. Forstå mekanismene i immununndragelser er avgjørende for utvikling av legemidler for trypanosomiasis. Antigenisk variasjon av det tette, Variant Surface glykoprotein (VSG) pels som dekker den parasitt er en av de primære middel som T. brucei omgår pattedyr antistoffrespons. Omtrent 2000 varianter av VSG-genet eksisterer i trypanosom genomet, men bare en er transkribert til enhver tid fra en av ~ 15 ekspresssjons nettsteder. "Bytte" av uttrykte VSG kan skje enten ved å kopiere en VSG gen inn i aktivt uttrykk nettstedet, eller ved transkripsjonen aktivering av en tidligere taus uttrykk hotellet (anmeldt i ^1).

Selv om mye arbeid har vært viet til å forstå antigen variasjon i T. brucei, hvilke faktorer som påvirker bytter frekvens er fortsatt dårlig forstått. Studier har hittil vært hindret av det faktum at mens svitsjing skjer stokastisk in vitro, taktfrekvenser er meget lav, i størrelsesorden av en på rundt 10 ⁶ celler ^2. Dette gjør det vanskelig å måle hvorvidt en gitt faktor øker eller synker bytter frekvens, ettersom vekslingen er vanskelig å oppdage i første omgang. Før 2009, metoder for å isolere skiftere i en gitt befolkning var lang og arbeidskrevende. Disse inkluderte aging trypanosomer gjennom mus immunisert mot den dominerende VSG og deretter høsting celleren dag senere ^3, eller telle hundrevis av celler ved immunofluorescens ^4,5. En annen strategi er avhengig av valg for legemiddelresistens å isolere skiftere ^6. Fordi afrikanske trypanosomer dyrket in vitro er vanligvis består av en stor befolkning som uttrykker en større variant, og en mye mindre befolkning på skiftere uttrykker alternative varianter, henviser vi til den store varianten gjennom dette papiret som den dominerende, som starter VSG. Ved å gjøre det vi ikke på noen måte ønsker å antyde at denne store varianten har større trenings enn andre varianter i befolkningen.

Her beskriver vi en fremgangsmåte som på en pålitelig måte kan måle antall trypanosomer som uttrykker et ikke-dominante VSG i en gitt populasjon i med 3 – 4 timer. Denne fremgangsmåten er spesielt nyttig når man ønsker å fastslå hvorvidt et gitt genetisk manipulering eller behandling øker antall svitsjede celler i en populasjon. I stedet for å bli kvitt populasjon av celler som uttrykker dominant, som starter VSG gjennom narkotika eller ved immunologiske midler, disse cellene fjernes ved først å belegge dem med magnetiske kuler koblet til antistoff mot den dominerende VSG og deretter isolere dem på en magnetisk kolonne. Den slått populasjon blir deretter samlet inn i gjennomstrømnings og farget igjen med en fluorofor-merket anti-VSG-antistoff for å identifisere fremmedstoffer. Kvantifisering blir oppnådd ved å legge til et definert antall absolutte telling perler til hver prøve, slik at forholdet mellom perlene til cellene kan bestemmes og brukes til å kvantifisere antallet av omformerenheter i populasjonen ^7.

Protocol

MERK: Gjennom prosedyren, er det nødvendig å holde cellene på is. Kalde medier bør også brukes hele. 1. Prøve Høsting Vokse Lister 427 påkjenning blodet trypanosomer til en tetthet på 0,5 – 1 million / ml. Det er best å starte kulturer med et lite antall parasitter. Spinn ned 50 x 10 6 celler / prøve i 10 min ved 1500 x g. Sørg for å la 1 x 10 6 celler i kultur for senere bruk som positive og negative antistoffkontroll. MERK: Denne protoko…

Representative Results

Metoden som beskrives her ble anvendt for å demonstrere at dobbelttrådsbrudd i den VSG uttrykket området økte antall omformerenheter i en populasjon 8. Her viser vi representative resultater fra en populasjon av trypanosomer som har blitt tilsvarende indusert for å generere en dobbel tråd pause på uttrykket området. Vi sammenligner disse trypanosomer til de som ikke er blitt indusert til å generere en dobbel tråd pause. Figur 1 viser representative f…

Discussion

Med hensyn til eksperimentell teknikk, er den mest kritiske del av protokollen holde alle prøvene kald. Trypanosomer meget hurtig internal antistoff bundet til sin overflate ^9, men denne fremgangsmåte er motilitet avhengig, og ikke påvirker analysen, så lenge cellene blir holdt ved 4 ° C. Alle prøver skal alltid holdes på is, og pipettering bør gjøres raskt å redusere eksponering for 25 ° C lab miljø. Cold HMI-9 med serum bør foreligge ved starten av eksperimentet og bør holdes på is i hele. Is…

Materials

unlabeled anti-VSG antibody	n/a	n/a	VSG antibody is made in house
fluorophore labeled anti-VSG antibody	n/a	n/a	VSG antibody is made in house
HMI-9 media	n/a	n/a	HMI-9 is made in house
Propidium Iodide	BD Pharmingen	556463
CountBright absolute counting beads	Thermofisher Scientific	C36950
LD columns	Miltenyi Biotech	130-042-901
MACS magnet	Miltenyi Biotech	130-042-303
MACS magnetic separator	Miltenyi Biotech	130-042-302
vortex adapter-60	ThermoFisher scientific	AM10014
flow cytometer	Coulter	n/a
flow cytometer analysis software	FloJo	n/a