طريقة بديلة لإعداد نموذج مع انخفاض عدد الخلايا لتحليل تيم
Summary
Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.
Abstract
انتقال المجهر الإلكتروني (تيم) على تفاصيل تنظيم الخلوية والتركيب الدقيق. ومع ذلك، وتحليل تيم من السكان الخلية نادرة، وخاصة الخلايا في تعليق مثل الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs)، لا يزال محدودا نظرا لاشتراط وجود عدد الخلايا عالية أثناء إعداد العينات. هناك عدد قليل من cytospin أو أحادي الطبقة نهج لتحليل تيم من عينات نادرة، ولكن هذه الأساليب تفشل في الحصول على بيانات كمية كبيرة من عدد محدود من الخلايا. هنا، يتم وصف نهج بديل ورواية لإعداد العينات في الدراسات تيم لسكان الخلية النادرة التي تمكن من تحليل الكمي.
عدد الخلايا منخفضة نسبيا، أي 10000 HSCs، وقد استخدمت بنجاح لتحليل تيم مقارنة ملايين الخلايا التي تستخدم عادة لدراسات تيم. على وجه الخصوص، تم تنفيذ ايفانز تلطيخ الأزرق بعد امتصاص العرق، غلوتارالدهيد (PFA-GA) تثبيت لتصور ااا خلية صغيرةالسماح، الأمر الذي سهل مبنية الاغاروز. وقد لوحظت مجموعات من الخلايا عديدة في قطاعات رقيقة جدا. كانت الخلايا التشكل الحفاظ عليها بشكل جيد، وكانت التفاصيل فائقة الهيكلية للالميتوكوندريا جولجي المعقدة وعدة مرئية. يسمح هذا البروتوكول كفاءة، وسهلة وقابلة للتكرار تحضير عينات من عدد الخلايا منخفضة، ويمكن استخدامها لتحليل تيم النوعي والكمي على السكان الخلية نادرة من العينات البيولوجية محدودة.
Introduction
وقد تم كشف النقاب عن تفاصيل فائقة الهيكلية وشبه العضيم بصفة أساسية من الخلايا بواسطة المجهر الإلكتروني انتقال (تيم) دراسات من الأنسجة أو الكريات خلية 1،2. القطع الصلبة من أنسجة يمكن استخدامها بسهولة للدراسات المجهر الإلكتروني. ومع ذلك، تيم يحلل 1،3 على الخلايا في تعليق تظل صعبة وتتطلب أعداد الخلايا عالية، أي الملايين من الخلايا. وبسبب هذا، تحليلات فائقة الهيكلية للسكان الخلية نادر في التعليق، وعلى سبيل المثال، الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs)، لا يتم تقييمها بسهولة. فشلت محاولات متعددة لتحليل تيم من العينات النادرة باستخدام cytospin أو أحادي الطبقة النهج للحصول على بيانات كمية كبير من عدد محدود من الخلايا. وهكذا، فإن اشتراط وجود عدد الخلايا عالية يحد من استخدام هذه الأداة القوية لفهم تفاصيل التركيبية التحت خلوية من السكان الخلية نادرة.
والقيد الرئيسي للدراسات تيم مع عدد محدود من الخلاياالصورة في تعليق هو توطين الخلايا للمعالجة، وبالتالي، لا تزال الدراسات تيم من خلايا محدودة مع بخاصة الأحجام الصغيرة الصعبة. وقد تم اعتماد عدة أساليب بديلة لمواجهة هذا القيد: جيش صرب البوسنة / bisacrylamide (BSA-BA) البلمرة بوساطة من تعليق خلية، وتلطيخ الخلايا مع صبغة لجعلها مرئية على دعم رقيقة بما coverslips، وتيم يحلل من الاستعدادات cytospin 4-6. ومع ذلك، تم تحقيق نجاح محدود جدا، كما تم العثور على عدد قليل جدا من الخلايا في الفروع بعد فائقة باجتزاء. التحدي الرئيسي المتمثل في تحديد الخلايا المتفرقة استمرت لأحادي الطبقة الخلية لا تزال في معظمها غير مرئية في هلام طدت لباجتزاء. وعلاوة على ذلك، وإعداد cytospin من الخلايا قد يغير منظمتهم الخلوية بسبب انتشار الخلايا وهشاشة بنية الخلية. وبالتالي، هذه العيوب المتأصلة تستدعي نهجا جديدا لإجراء دراسات تيم من السكان الخلية نادرة مع أكثرالتناسق. للتغلب على هذه المشكلة، التي وصفناها رواية وعينة بديلة طريقة التحضير للدراسات تيم من السكان الخلية نادرة 7.
هنا، نحن الإبلاغ عن كفاءة بروتوكول إعداد نموذج لأداء تيم من العينات البيولوجية النادرة مع النتائج النوعية والكمية متسقة. تم إجراء ايفانز تلطيخ الأزرق بعد تثبيت لتوطين بيليه خلية صغيرة من الخلايا انخفاض عدد، أي 10000 نخاع العظم الجذعية المكونة للدم والخلايا الاولية التي لولاها بقيت غير مرئية، وكان جزءا لا يتجزأ من بيليه إلى الاغاروز قبل عمليات الجفاف والراتنج التضمين. هذه الطريقة مجموعات الخلايا معا، ويمكن تحليل كفاءة التركيب الدقيق وتنظيم التحت خلوية من الخلايا الجذعية المكونة للدم (يدعى لين – هيئة السلع التموينية-1 + ج كيت + Flt3 – CD34 -، شهادة الثانوية العامة)، نادر 0.2 – السكان الخلية 0.5٪ في نخاع العظام. هذا الموالية التجريبيtocol يمكن أن تكون مفيدة لإجراء دراسات فائقة الهيكلية والحصول على النتائج الكمية على العديد من السكان نادر لكنه مهم للغاية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تمكن هذه الطريقة تحليل تيم على أرقام الهواتف المحمولة المنخفضة، باستخدام ايفانز تلطيخ الأزرق والاغاروز التضمين في توطين بيليه خلية صغيرة خلال الجفاف، التضمين الراتنج والعمليات باجتزاء. الأهم من ذلك أنها تحتفظ مجموعات الخلايا معا، ويحافظ على الخلية فائقة هيكل، الذ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Pathology Research Core for assistance with electron microscope analysis studies at Cincinnati Children’s Hospital Medical Center. The work was supported by NIH (American Society of Hematology Bridge award to-MDF; R01 DK102890 to MDF).
Materials
| Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 15713 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 16350 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Cacodyladate buffer | Electron microscopy Sciences | 12300 | Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4°C. CAUTION Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood. |
| Evans Blue | Sigma | E-2129 | |
| Low melting agarose | Sigma Aldrich | A-5030 | |
| Osmium tetraoxide | Electron microscopy Sciences | 19130 | 1 gm in 50 ml of 0.1M Cacodyladate buffer to make 2% OsO4 stock, CAUTION Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood. |
| LX-112 Embedding Kits (LADD®) | |||
| DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride) | LADD | 21340 | Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30 |
| NMA (Nadic methyl anhydride) | LADD | 21350 | |
| Epoxy Resins Epon 812 (LX-112) | LADD | 21310 | CAUTION Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood. |
| DMP-30 (2,4,6 -Tri(dimethylaminomethyl)phenol) | LADD | 21370 | |
| Reynolds lead citrate (EM Stain II) | Leica | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. | |
| Uranyl acetate (EM Stain I) | Leica | 8072820 | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ATCC | 30-2005 | composition: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. For for details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx |
| Pyramid tip mold | Ted Pella | 10585 | |
| mounting cylinders | Ted Pella | 10580 | |
| Ultra-microtome | (Leica EM UC7) | ||
| 200 mesh grids (nikil) | Electron microscopy Sciences | G-200 Ni | |
| Electron Microscope | Hitachi model H-7650 | ||
| Image capture engine software | AMT-600 | ||
| 35 mm plastic petri dishes | Fisher scientific | ||
| Quick Bond Super glue Cyanoacrylate | Electron microscopy Sciences | 72588 | |
| Razor blades | |||
| Glass scintillation vials | Fisher scientific | 03-337-14 | |
| Glass slides | |||
| Eyelash tool | |||
| Metal Loop tool |
References
- Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).
- Leapman, R. D. Novel techniques in electron microscopy. Curr Opin Neurobiol. 14, 591-598 (2004).
- Anderson, D. R. A method of preparing peripheral leucocytes for electron microscopy. J Ulstract Res. 13, 263-268 (1965).
- Taupin, P. Processing scarce biological samples for light and transmission electron microscopy. Eur J Histochem. 52, 135-139 (2008).
- Mather, J., Stanbridge, C. M., Butler, E. B. Method for the removal of selected cells from cytological smear preparations for transmission electron microscopy. J Clin Pathol. 34, 1355-1357 (1981).
- Oorschot, V., de Wit, H., Annaert, W. G., Klumperman, J. A novel flat-embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation. J Histochem Cytochem. 50, 1067-1080 (2002).
- Kumar, S., Ciraolo, G., Hinge, A., Filippi, M. D. An efficient and reproducible process for transmission electron microscopy (TEM) of rare cell populations. J Immunol Methods. 404, 87-90 (2014).
- Chen, J., et al. Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice. Exp Hematol. 36, 1236-1243 (2008).
- Hopwood, D. The reactions between formaldehyde, glutaraldehyde and osmium tetroxide, and their fixation effects o bovine serum albumin and on tissue blocks. Histochemistry. 24, 50-64 (1970).
- Saini, R., et al. Nitric oxide synthase localization in the rat neutrophils: immunocytochemical, molecular, and biochemical studies. J Leukoc Biol. 79, 519-528 (2006).
- Kumar, S., et al. The small GTPase Rap1b negatively regulates neutrophil chemotaxis and transcellular diapedesis by inhibiting Akt activation. J Exp Med. 211, 1741-1758 (2014).
