Een alternatieve benadering voor Monstervoorbereidingstesten met een lage aantal cellen voor TEM Analyse
Summary
Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.
Abstract
Transmissie elektronen microscopie (TEM) geeft details van de cellulaire organisatie en ultrastructuur. Echter, TEM analyse van zeldzame celpopulaties, met name cellen in suspensie zoals hematopoietische stamcellen (HSCs) blijft beperkt door de eis van een hoog aantal cellen tijdens de voorbehandeling. Er zijn enkele cytospin of monolaag benaderingen TEM analyse van schaarse monsters, maar deze benaderingen niet significante kwantitatieve gegevens uit het beperkte aantal cellen. Hier wordt een alternatieve en nieuwe benadering voor de monstervoorbereiding in TEM studies beschreven voor zeldzame celpopulaties dat kwantitatieve analyse mogelijk maakt.
Een relatief laag aantal cellen, dat wil zeggen, 10.000 HSCs, werd met succes gebruikt voor TEM analyse werden de miljoenen cellen doorgaans gebruikt voor TEM studies. In het bijzonder werd Evans blauw kleuring uitgevoerd na paraformaldehyde-glutaaraldehyde fixatie (PFA-GA) naar het kleine cel pel visualiserenlaat die gefaciliteerd inbedding in agarose. Clusters van talrijke cellen waargenomen in ultra-dunne secties. De cellen hadden een goed bewaard morfologie en de ultra-structurele details van het Golgi complex en verschillende mitochondriën toegankelijk. Deze efficiënte, eenvoudige en reproduceerbare protocol maakt monstervoorbereiding van geringe aantal cellen en kan worden gebruikt voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van TEM zeldzame celpopulaties van biologische monsters beperkt.
Introduction
Ultra-structurele en suborganel data van cellen zijn voornamelijk aangetoond door transmissie- elektronenmicroscopie (TEM) studies weefsels of celpellets 1,2. Stevige stukjes weefsel kan eenvoudig worden gebruikt voor elektronenmicroscopie studies. Echter, TEM analyse 1,3 op cellen in suspensie blijven uitdagend en vereisen hoge celaantallen, dwz miljoenen cellen. Hierdoor ultra-structurele analyses van zeldzame celpopulaties in suspensie, bijvoorbeeld hematopoietische stamcellen (HSC) worden niet gemakkelijk beoordeeld. Meerdere pogingen voor TEM analyse van schaarse monsters met behulp van cytospin of monolaag benaderingen niet aan belangrijke kwantitatieve gegevens te krijgen van het beperkte aantal cellen. Zo is de eis van een hoog aantal cellen beperkt het gebruik van deze krachtige instrument om de subcellulaire ultrastructurele data van zeldzame celpopulaties begrijpen.
Een belangrijke beperking voor TEM studies met een beperkt aantal van de cels in suspensie is de lokalisatie van de cellen voor verwerking en dus TEM onderzoeken van beperkte cellen met bijzonder kleine afmetingen blijven uitdagend. Verschillende alternatieve benaderingen zijn genomen om deze beperking tegen te gaan: de BSA / bisacrylamide (BSA-BA) gemedieerde polymerisatie van celsuspensie, de kleuring van cellen met een kleurstof ze zichtbaar op een dunne film-ondersteuning, inclusief dekglaasjes te maken, en TEM analyses van cytospinpreparaten 4-6. Echter, was zeer beperkt succes, als zeer weinig cellen werden gevonden in de secties na ultra-snijden. De belangrijkste uitdaging voor het identificeren van schaarse cellen blijft bestaan, omdat de cel monolaag grotendeels onzichtbaar in de gestolde gel voor het snijden blijft. Bovendien kunnen cytospine bereiding van cellen hun cellulaire organisatie veranderen door celspreiding en de kwetsbaarheid van de celstructuur. Vandaar dat deze inherente nadelen rechtvaardigen een nieuwe benadering voor TEM studies uit te voeren vanaf zeldzame celpopulaties met meerconsistentie. Om dit probleem op te lossen, hebben we een nieuwe en alternatieve monstervoorbereiding methode beschreven voor TEM studies zeldzame celpopulaties 7.
Hier melden wij een efficiënte monstervoorbereiding protocol om TEM uit te voeren vanaf schaarse biologische monsters met consistente kwalitatieve en kwantitatieve resultaten. Evans blauw kleuring werd uitgevoerd na bevestiging aan een kleine cel pellet van lage aantal cellen, dat wil zeggen, 10.000 beenmerg hematopoietische stamcellen en stamcellen die anders onzichtbaar zou zijn gebleven lokaliseren, en de pellet werd ingebed in agarose voor uitdroging en hars inbedding processen. Deze methode bundelt de cellen elkaar en maakt een efficiënte analyse van de ultrastructuur en subcellulaire organisatie van hematopoietische stamcellen (aangeduid als Lin – Sca-1 + c-Kit + Flt3 – CD34 -, HSC), een zeldzame 0,2-0,5% celpopulatie in het beenmerg. Deze experimentele proprotocol kan nuttig zijn om ultra-structurele studies uit te voeren en de kwantitatieve resultaten op vele zeldzame, maar zeer belangrijke populatie te verkrijgen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze methode maakt het mogelijk TEM analyse van laag aantal cellen, met behulp van Evans blauwe vlekken en agarose inbedding een kleine cel pellet te lokaliseren tijdens de uitdroging, hars inbedding en snijden processen. Belangrijk stelt zij celgroepen elkaar en behoudt de cel ultra-structuur, hetgeen wenselijk om meerdere cellen voor het kwantificeren van data worden onderzocht.
In TEM onderzoeken, wordt een celpellet met miljoenen cellen vaak vereist voor een efficiënte inbedding in een …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Pathology Research Core for assistance with electron microscope analysis studies at Cincinnati Children’s Hospital Medical Center. The work was supported by NIH (American Society of Hematology Bridge award to-MDF; R01 DK102890 to MDF).
Materials
| Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 15713 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 16350 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Cacodyladate buffer | Electron microscopy Sciences | 12300 | Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4°C. CAUTION Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood. |
| Evans Blue | Sigma | E-2129 | |
| Low melting agarose | Sigma Aldrich | A-5030 | |
| Osmium tetraoxide | Electron microscopy Sciences | 19130 | 1 gm in 50 ml of 0.1M Cacodyladate buffer to make 2% OsO4 stock, CAUTION Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood. |
| LX-112 Embedding Kits (LADD®) | |||
| DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride) | LADD | 21340 | Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30 |
| NMA (Nadic methyl anhydride) | LADD | 21350 | |
| Epoxy Resins Epon 812 (LX-112) | LADD | 21310 | CAUTION Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood. |
| DMP-30 (2,4,6 -Tri(dimethylaminomethyl)phenol) | LADD | 21370 | |
| Reynolds lead citrate (EM Stain II) | Leica | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. | |
| Uranyl acetate (EM Stain I) | Leica | 8072820 | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ATCC | 30-2005 | composition: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. For for details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx |
| Pyramid tip mold | Ted Pella | 10585 | |
| mounting cylinders | Ted Pella | 10580 | |
| Ultra-microtome | (Leica EM UC7) | ||
| 200 mesh grids (nikil) | Electron microscopy Sciences | G-200 Ni | |
| Electron Microscope | Hitachi model H-7650 | ||
| Image capture engine software | AMT-600 | ||
| 35 mm plastic petri dishes | Fisher scientific | ||
| Quick Bond Super glue Cyanoacrylate | Electron microscopy Sciences | 72588 | |
| Razor blades | |||
| Glass scintillation vials | Fisher scientific | 03-337-14 | |
| Glass slides | |||
| Eyelash tool | |||
| Metal Loop tool |
References
- Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).
- Leapman, R. D. Novel techniques in electron microscopy. Curr Opin Neurobiol. 14, 591-598 (2004).
- Anderson, D. R. A method of preparing peripheral leucocytes for electron microscopy. J Ulstract Res. 13, 263-268 (1965).
- Taupin, P. Processing scarce biological samples for light and transmission electron microscopy. Eur J Histochem. 52, 135-139 (2008).
- Mather, J., Stanbridge, C. M., Butler, E. B. Method for the removal of selected cells from cytological smear preparations for transmission electron microscopy. J Clin Pathol. 34, 1355-1357 (1981).
- Oorschot, V., de Wit, H., Annaert, W. G., Klumperman, J. A novel flat-embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation. J Histochem Cytochem. 50, 1067-1080 (2002).
- Kumar, S., Ciraolo, G., Hinge, A., Filippi, M. D. An efficient and reproducible process for transmission electron microscopy (TEM) of rare cell populations. J Immunol Methods. 404, 87-90 (2014).
- Chen, J., et al. Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice. Exp Hematol. 36, 1236-1243 (2008).
- Hopwood, D. The reactions between formaldehyde, glutaraldehyde and osmium tetroxide, and their fixation effects o bovine serum albumin and on tissue blocks. Histochemistry. 24, 50-64 (1970).
- Saini, R., et al. Nitric oxide synthase localization in the rat neutrophils: immunocytochemical, molecular, and biochemical studies. J Leukoc Biol. 79, 519-528 (2006).
- Kumar, S., et al. The small GTPase Rap1b negatively regulates neutrophil chemotaxis and transcellular diapedesis by inhibiting Akt activation. J Exp Med. 211, 1741-1758 (2014).
