Un approccio alternativo per la preparazione del campione con un basso numero di cellule per l'analisi TEM
Summary
Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.
Abstract
microscopia elettronica a trasmissione (TEM) fornisce i dettagli della organizzazione cellulare e ultrastruttura. Tuttavia, l'analisi TEM di popolazioni di cellule rare, in particolare le cellule in sospensione come le cellule staminali ematopoietiche (CSE), rimane limitata a causa della necessità di un elevato numero di cellule durante la loro preparazione. Ci sono alcuni approcci cytospin o monostrato per analisi TEM da campioni scarse, ma questi approcci non riescono a ottenere dati quantitativi significativi dal numero limitato di cellule. Qui, un approccio alternativo e innovativo per la preparazione del campione negli studi TEM è descritto per le popolazioni di cellule rare che consente l'analisi quantitativa.
Un numero relativamente basso di cellule, cioè, 10.000 CSE, è stato utilizzato con successo per l'analisi TEM rispetto ai milioni di cellule tipicamente utilizzati per gli studi TEM. In particolare, Evans blu colorazione è stata eseguita dopo paraformaldeide-glutaraldeide (PFA-GA) la fissazione di visualizzare la minuscola cella pellasciare, che ha facilitato l'incorporamento in agarosio. Grappoli di numerose cellule sono stati osservati nelle sezioni ultrasottili. Le cellule hanno una morfologia ben conservato, ei dettagli ultra-strutturali dei mitocondri Golgi complesse e diverse erano visibili. Questo protocollo efficiente, semplice e riproducibile permette la preparazione del campione da un numero di cellule basso e può essere utilizzato per l'analisi qualitativa e quantitativa TEM su popolazioni di cellule rare da campioni biologici limitate.
Introduction
Dettagli Ultra-strutturali e sub-organelli delle cellule sono stati rivelati principalmente mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) studi da tessuti o pellet cellulari 1,2. pezzi solidi di tessuti possono essere facilmente utilizzati per studi di microscopia elettronica. Tuttavia, TEM analizza 1,3 su cellule in sospensione rimangono una sfida e rendono necessario il numero di cellule alte, vale a dire, milioni di cellule. A causa di questo, analisi ultra-strutturali delle popolazioni cellulari rare in sospensione, ad esempio, cellule staminali ematopoietiche (CSE), non sono facilmente valutati. Molteplici tentativi di analisi TEM da campioni scarse utilizzando cytospin o monostrato approcci non riescono a ottenere dati quantitativi significativi dal limitato numero di celle. Pertanto, il requisito di un elevato numero di cellule limita l'uso di questo potente strumento per comprendere i dettagli ultrastrutturali subcellulari di popolazioni di cellule rare.
Una limitazione fondamentale per studi TEM con un numero limitato di cellules in sospensione è la localizzazione delle cellule per la lavorazione e quindi, studi TEM da cellule limitati con particolare piccole dimensioni rimangono impegnativo. Diversi approcci alternativi sono stati adottati per contrastare questa limitazione: la BSA / bisacrylamide (BSA-BA) polimerizzazione mediata di sospensione cellulare, la colorazione delle cellule con un colorante per renderli visibili su un supporto sottile pellicola tra cui lamelle, e TEM analizza dalle preparazioni cytospin 4-6. Tuttavia, il successo molto limitato è stato raggiunto, come molto poche cellule sono stati trovati in sezioni dopo ultra-sezionamento. La sfida principale di identificare cellule sparse persiste perché il monostrato cellulare rimane per lo più invisibile nel gel solidificato per il sezionamento. Inoltre, la preparazione cytospin delle cellule può alterare la loro organizzazione cellulare dovuta alla diffusione delle cellule e la fragilità della struttura cellulare. Quindi, questi inconvenienti intrinseci giustificano un nuovo approccio per eseguire studi TEM da popolazioni di cellule rare con piùconsistenza. Per superare questo problema, abbiamo descritto un nuovo metodo di preparazione del campione e alternativa a studi TEM da popolazioni di cellule rare 7.
Qui riportiamo un efficiente protocollo di preparazione del campione per eseguire TEM da campioni biologici scarse con risultati qualitativi e quantitativi consistenti. Evans blu colorazione è stata eseguita dopo la fissazione di localizzare un piccolo pellet di cellule dalle cellule basso numero, cioè, staminali emopoietiche del midollo osseo 10.000 e le cellule progenitrici che altrimenti sarebbero rimaste invisibili, e il pellet è stato incorporato in agarosio prima processi di disidratazione e resina embedding. Questo metodo raggruppa insieme le cellule e permette l'analisi efficiente della ultrastruttura e l'organizzazione subcellulare di cellule staminali ematopoietiche (identificato come Lin – Sca-1 + c-Kit + Flt3 – CD34 -, HSC), un 0.2 rara – popolazione di cellule 0,5% nel midollo osseo. Questo pro sperimentaleprotocollo può essere utile per effettuare studi ultra-strutturali e di ottenere risultati quantitativi in molte popolazioni rari ma molto importanti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo metodo consente l'analisi TEM sul numero di cellule bassi, utilizzando Evans colorazione blu e agarosio l'incorporamento di localizzare un piccolo pellet di cellule durante la disidratazione, embedding resina e sezionamento processi. Importante, mantiene raggruppamenti cellulari insieme e conserva la ultra-struttura cellulare, che è opportuno esaminare più celle per la quantificazione dei dati.
In studi TEM, un pellet di cellule contenente milioni di cellule è spesso necess…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Pathology Research Core for assistance with electron microscope analysis studies at Cincinnati Children’s Hospital Medical Center. The work was supported by NIH (American Society of Hematology Bridge award to-MDF; R01 DK102890 to MDF).
Materials
| Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 15713 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 16350 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Cacodyladate buffer | Electron microscopy Sciences | 12300 | Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4°C. CAUTION Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood. |
| Evans Blue | Sigma | E-2129 | |
| Low melting agarose | Sigma Aldrich | A-5030 | |
| Osmium tetraoxide | Electron microscopy Sciences | 19130 | 1 gm in 50 ml of 0.1M Cacodyladate buffer to make 2% OsO4 stock, CAUTION Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood. |
| LX-112 Embedding Kits (LADD®) | |||
| DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride) | LADD | 21340 | Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30 |
| NMA (Nadic methyl anhydride) | LADD | 21350 | |
| Epoxy Resins Epon 812 (LX-112) | LADD | 21310 | CAUTION Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood. |
| DMP-30 (2,4,6 -Tri(dimethylaminomethyl)phenol) | LADD | 21370 | |
| Reynolds lead citrate (EM Stain II) | Leica | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. | |
| Uranyl acetate (EM Stain I) | Leica | 8072820 | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ATCC | 30-2005 | composition: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. For for details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx |
| Pyramid tip mold | Ted Pella | 10585 | |
| mounting cylinders | Ted Pella | 10580 | |
| Ultra-microtome | (Leica EM UC7) | ||
| 200 mesh grids (nikil) | Electron microscopy Sciences | G-200 Ni | |
| Electron Microscope | Hitachi model H-7650 | ||
| Image capture engine software | AMT-600 | ||
| 35 mm plastic petri dishes | Fisher scientific | ||
| Quick Bond Super glue Cyanoacrylate | Electron microscopy Sciences | 72588 | |
| Razor blades | |||
| Glass scintillation vials | Fisher scientific | 03-337-14 | |
| Glass slides | |||
| Eyelash tool | |||
| Metal Loop tool |
References
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