En alternativ tilnærming for prøveopparbeidelse med lav celle nummer for TEM Analysis
Summary
Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.
Abstract
Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) gir detaljer om den cellulære organisasjon og ultrastruktur. Men TEM analyse av sjeldne celle populasjoner, spesielt celler i suspensjon som blodkreft stamceller (HSCs), fortsatt begrenset på grunn av kravet om et høyt celle nummer under tillagingen. Det er noen cytospin eller monolags tilnærminger for TEM-analyse fra knappe prøver, men disse metodene ikke klarer å få signifikante kvantitative data fra et begrenset antall celler. Her er en alternativ og ny tilnærming for prøveopparbeidelse i TEM studier beskrevet for sjeldne celle populasjoner som gjør at kvantitativ analyse.
En forholdsvis lav cellenummer, dvs. 10000 HSCs, ble med hell anvendt for TEM-analyse i forhold til de millioner av celler som vanligvis brukes for TEM-studier. Spesielt ble Evans blå flekker utført etter paraformaldehyde-glutaraldehyd (PFA-GA) fiksering for å visualisere den lille cellen pella, som tilrettelagt embedding i agarose. Klynger av mange celler ble observert i ultra-tynne snitt. Cellene hadde et godt bevart morfologi, og det ultra-strukturelle detaljer av Golgi-komplekset og flere mitokondrier var synlig. Dette effektiv, enkel og reproduserbar protokollen tillater prøvepreparat fra en lav cellenummer, og kan brukes til kvalitativ og kvantitativ analyse TEM på sjeldne cellepopulasjoner fra begrensede biologiske prøver.
Introduction
Ultra-strukturelle og sub-organelle detaljer om cellene har blitt hovedsakelig avslørt av transmisjonselektronmikroskopi (TEM) studier fra vev eller celle pellets 1,2. Solid biter av vev kan lett utnyttes for elektronmikroskopi studier. Men analyser TEM 1,3 på celler i suspensjon fortsatt utfordrende og nødvendig høye celletall, dvs. millioner av celler. På grunn av dette, ultra-strukturelle analyser av sjeldne cellepopulasjoner i suspensjon, f.eks, hematopoetiske stamceller (HSCs), er ikke lett vurderes. Flere forsøk for TEM-analyse fra knappe eksempler ved å bruke cytospin eller monolagsfremgangsmåter ikke klarer å få vesentlig kvantitative data fra et begrenset antall celler. Dermed blir kravet om et høyt celle nummer begrenser bruken av dette kraftige verktøyet for å forstå subcellulære ultra detaljer om sjeldne celle populasjoner.
En viktig begrensning for TEM-studier med et begrenset antall celles i suspensjon er lokalisering av cellene for behandling og dermed TEM-studier fra begrensede celler med særlig små størrelser forbli utfordrende. Flere alternative tilnærminger har blitt vedtatt for å motvirke denne begrensningen: BSA / bisacrylamide (BSA-BA) mediert polymerisasjon av cellesuspensjon, farging av celler med et fargestoff for å gjøre dem synlige på en tynn film-støtte, inkludert Dekk, og TEM analyser fra Cytospin forberedelser 4-6. Men svært begrenset suksess ble oppnådd, som svært få celler ble funnet i avsnittene etter ultra-seksjonering. Hovedutfordringen med å identifisere spredte celler vedvarer fordi cellemonolaget forblir stort sett usynlig i størknet gel for seksjonering. Videre kan cytospin fremstilling av celler forandre deres cellulære organisasjon på grunn av celle spredning og skjørheten av cellestrukturen. Derfor er disse iboende ulemper garanterer en ny tilnærming for å utføre TEM studier av sjeldne cellepopulasjoner med merkonsistens. For å bøte på dette problemet, har vi beskrevet en ny og alternativ prøveopparbeidelse metode for TEM-studier fra sjeldne celle populasjoner 7.
Her rapporterer vi en effektiv prøveopparbeidelse protokollen for å utføre TEM fra knappe biologiske prøver med konsekvent kvalitative og kvantitative resultater. Evans blue farging ble utført etter fiksering for å lokalisere en liten celle pellet fra lavt antall celler, dvs. 10 000 benmarg blodkreft stilk og stamceller som ellers ville ha forblitt usynlig, og pelleten ble innebygd i agarose før dehydrering og harpiks innebygging prosesser. Denne fremgangsmåte klynger cellene sammen og muliggjør effektiv analyse av ultra og subcellulære organisering av hematopoetiske stamceller (identifisert som Lin – Sca-1 + c-kit + Flt3 – CD34 -; HSC), en sjelden 0,2 til 0,5%-cellepopulasjonen i benmargen. Dette eksperimentell proprotokollen kan være nyttig å utføre ultrastrukturstudier og få kvantitative resultater på mange sjeldne, men svært viktige bestander.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne metoden gjør det mulig TEM analyse på lave celle tall, ved hjelp av Evans blå flekker og agarose innebygging for å lokalisere en liten celle pellet i løpet av dehydrering, harpiks innebygging og seksjonering prosesser. Viktigere, opprettholder det cellegrupper sammen og bevarer det celle ultra-struktur, noe som er ønskelig å undersøke flere celler for kvantifisering av data.
I TEM-studier, er en cellepellet inneholder millioner av celler som ofte er nødvendig for effektiv inns…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Pathology Research Core for assistance with electron microscope analysis studies at Cincinnati Children’s Hospital Medical Center. The work was supported by NIH (American Society of Hematology Bridge award to-MDF; R01 DK102890 to MDF).
Materials
| Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 15713 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 16350 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Cacodyladate buffer | Electron microscopy Sciences | 12300 | Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4°C. CAUTION Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood. |
| Evans Blue | Sigma | E-2129 | |
| Low melting agarose | Sigma Aldrich | A-5030 | |
| Osmium tetraoxide | Electron microscopy Sciences | 19130 | 1 gm in 50 ml of 0.1M Cacodyladate buffer to make 2% OsO4 stock, CAUTION Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood. |
| LX-112 Embedding Kits (LADD®) | |||
| DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride) | LADD | 21340 | Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30 |
| NMA (Nadic methyl anhydride) | LADD | 21350 | |
| Epoxy Resins Epon 812 (LX-112) | LADD | 21310 | CAUTION Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood. |
| DMP-30 (2,4,6 -Tri(dimethylaminomethyl)phenol) | LADD | 21370 | |
| Reynolds lead citrate (EM Stain II) | Leica | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. | |
| Uranyl acetate (EM Stain I) | Leica | 8072820 | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ATCC | 30-2005 | composition: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. For for details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx |
| Pyramid tip mold | Ted Pella | 10585 | |
| mounting cylinders | Ted Pella | 10580 | |
| Ultra-microtome | (Leica EM UC7) | ||
| 200 mesh grids (nikil) | Electron microscopy Sciences | G-200 Ni | |
| Electron Microscope | Hitachi model H-7650 | ||
| Image capture engine software | AMT-600 | ||
| 35 mm plastic petri dishes | Fisher scientific | ||
| Quick Bond Super glue Cyanoacrylate | Electron microscopy Sciences | 72588 | |
| Razor blades | |||
| Glass scintillation vials | Fisher scientific | 03-337-14 | |
| Glass slides | |||
| Eyelash tool | |||
| Metal Loop tool |
References
- Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).
- Leapman, R. D. Novel techniques in electron microscopy. Curr Opin Neurobiol. 14, 591-598 (2004).
- Anderson, D. R. A method of preparing peripheral leucocytes for electron microscopy. J Ulstract Res. 13, 263-268 (1965).
- Taupin, P. Processing scarce biological samples for light and transmission electron microscopy. Eur J Histochem. 52, 135-139 (2008).
- Mather, J., Stanbridge, C. M., Butler, E. B. Method for the removal of selected cells from cytological smear preparations for transmission electron microscopy. J Clin Pathol. 34, 1355-1357 (1981).
- Oorschot, V., de Wit, H., Annaert, W. G., Klumperman, J. A novel flat-embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation. J Histochem Cytochem. 50, 1067-1080 (2002).
- Kumar, S., Ciraolo, G., Hinge, A., Filippi, M. D. An efficient and reproducible process for transmission electron microscopy (TEM) of rare cell populations. J Immunol Methods. 404, 87-90 (2014).
- Chen, J., et al. Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice. Exp Hematol. 36, 1236-1243 (2008).
- Hopwood, D. The reactions between formaldehyde, glutaraldehyde and osmium tetroxide, and their fixation effects o bovine serum albumin and on tissue blocks. Histochemistry. 24, 50-64 (1970).
- Saini, R., et al. Nitric oxide synthase localization in the rat neutrophils: immunocytochemical, molecular, and biochemical studies. J Leukoc Biol. 79, 519-528 (2006).
- Kumar, S., et al. The small GTPase Rap1b negatively regulates neutrophil chemotaxis and transcellular diapedesis by inhibiting Akt activation. J Exp Med. 211, 1741-1758 (2014).
