Uma abordagem alternativa para preparação de amostras com baixo número de celular de Análise TEM
Summary
Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.
Abstract
microscopia eletrônica de transmissão (TEM) fornece detalhes sobre a organização celular e ultra-estrutura. No entanto, a análise TEM de populações de células raras, especialmente as células em suspensão, tais como células estaminais hematopoiéticas (HSCs), permanece limitada devido à exigência de um elevado número de células durante a preparação da amostra. Há um cytospin ou monocamada algumas abordagens para a análise de MET a partir de amostras escassos, mas estas abordagens não conseguem obter os dados quantitativos significativos do número limitado de células. Aqui, uma abordagem alternativa e inovadora para preparação de amostras em estudos TEM é descrito para populações de células raras que permite a análise quantitativa.
Um número de células relativamente baixa, ou seja, 10.000 HSCs, foi utilizado com sucesso para a análise de TEM em comparação com os milhões de células, tipicamente utilizados para estudos TEM. Em particular, Evans azul coloração foi realizada após paraformaldeído-glutaraldeído (PFA-GA) de fixação para visualizar o pequeno pel celularvamos, o que facilitou a incorporação de agarose. Aglomerados de numerosas células foram observadas em seções ultra-finas. As células tinham uma morfologia bem conservada, e os detalhes de ultra-estruturais das mitocôndrias e vários complexos de Golgi eram visíveis. Este protocolo eficiente, fácil e reprodutível permite a preparação da amostra a partir de um número de células de baixo e pode ser usado para a análise TEM qualitativa e quantitativa sobre as populações de células raras a partir de amostras biológicas limitados.
Introduction
Detalhes ultra-estruturais e sub-organela das células foram revelados principalmente por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) estudos de tecidos ou pellets de células 1,2. peças sólidas de tecidos pode ser facilmente utilizada para estudos de microscopia electrónica. No entanto, análises de MET 1,3 em células em suspensão e necessitam de permanecer desafiador números elevados de células, isto é, milhões de células. Devido a isso, análises de ultra-estruturais das populações de células raras em suspensão, por exemplo, células estaminais hematopoiéticas (HSCs), não são facilmente avaliados. Várias tentativas para análise de TEM de amostras usando escassos cytospin ou monocamada abordagens não conseguem obter os dados quantitativos significativa do número limitado de células. Deste modo, a exigência de um elevado número de células limita a utilização desta ferramenta poderosa para compreender os detalhes ultraestruturais subcelulares de populações de células raras.
Uma limitação fundamental para estudos TEM com um número limitado de célulass em suspensão, é a localização das células para o processamento e, portanto, a partir de estudos TEM células limitadas com tamanhos especialmente pequenos permanecem desafiador. Várias abordagens alternativas foram adotadas para contrariar esta limitação: a BSA / bisacrilamida (BSA-BA) polimerização mediada de suspensão de células, a coloração das células com um corante para torná-los visíveis num suporte de película fina incluindo lamelas, e analisa MET a partir de preparações de Cytospin 4-6. No entanto, o sucesso muito limitado foi alcançado, como muito poucas células foram encontrados nas secções após ultra-seccionamento. O principal desafio de identificar células esparsas persiste porque a monocamada de células permanece praticamente invisível no gel solidificado para seccionamento. Além disso, a preparação Cytospin de células pode alterar a sua organização celular devido ao espalhamento das células e a fragilidade da estrutura celular. Por conseguinte, estes inconvenientes inerentes garante uma nova abordagem para a realização de estudos de MET a partir de populações de células raras com maisconsistência. Para ultrapassar este problema, nós descrevemos um método novo e preparação de amostras alternativa para estudos TEM de populações de células raras 7.
Aqui, descrevemos um protocolo de preparação da amostra eficiente para realizar TEM de amostras biológicas escassos com resultados qualitativos e quantitativos consistentes. O azul de Evans foi realizada a coloração após a fixação de localizar um pequeno agregado de células a partir de células baixo número, ou seja, 10.000 tronco hematopoiéticas da medula óssea e células progenitoras que de outra forma teriam permanecido invisível, e o sedimento foi incorporado em agarose antes de processos de desidratação e de resina de incorporação. Este método agrupa as células em conjunto e permite a análise eficiente da ultra-estrutura e organização subcelular das células estaminais hematopoiéticas (identificado como Lin – Sca-1 + c-kit + Flt3 – CD34 -; HSC), um raro 0,2 – população de células 0,5% na medula óssea. Este pro experimentalprotocolo pode ser útil para realizar estudos ultra-estruturais e obter resultados quantitativos sobre muitas populações raras, mas muito importantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este método permite a análise TEM em números de celulares de baixo, usando Evans coloração azul e agarose a incorporação de localizar um pellet de células pequenas durante a desidratação, inclusão em resina e seccionamento processos. É importante notar que mantém agrupamentos de células em conjunto e preserva a ultra-estrutura celular, o que é desejável para examinar várias células para quantificação de dados.
Em estudos TEM, um sedimento celular, contendo milhões de cé…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Pathology Research Core for assistance with electron microscope analysis studies at Cincinnati Children’s Hospital Medical Center. The work was supported by NIH (American Society of Hematology Bridge award to-MDF; R01 DK102890 to MDF).
Materials
| Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 15713 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 16350 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Cacodyladate buffer | Electron microscopy Sciences | 12300 | Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4°C. CAUTION Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood. |
| Evans Blue | Sigma | E-2129 | |
| Low melting agarose | Sigma Aldrich | A-5030 | |
| Osmium tetraoxide | Electron microscopy Sciences | 19130 | 1 gm in 50 ml of 0.1M Cacodyladate buffer to make 2% OsO4 stock, CAUTION Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood. |
| LX-112 Embedding Kits (LADD®) | |||
| DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride) | LADD | 21340 | Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30 |
| NMA (Nadic methyl anhydride) | LADD | 21350 | |
| Epoxy Resins Epon 812 (LX-112) | LADD | 21310 | CAUTION Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood. |
| DMP-30 (2,4,6 -Tri(dimethylaminomethyl)phenol) | LADD | 21370 | |
| Reynolds lead citrate (EM Stain II) | Leica | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. | |
| Uranyl acetate (EM Stain I) | Leica | 8072820 | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ATCC | 30-2005 | composition: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. For for details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx |
| Pyramid tip mold | Ted Pella | 10585 | |
| mounting cylinders | Ted Pella | 10580 | |
| Ultra-microtome | (Leica EM UC7) | ||
| 200 mesh grids (nikil) | Electron microscopy Sciences | G-200 Ni | |
| Electron Microscope | Hitachi model H-7650 | ||
| Image capture engine software | AMT-600 | ||
| 35 mm plastic petri dishes | Fisher scientific | ||
| Quick Bond Super glue Cyanoacrylate | Electron microscopy Sciences | 72588 | |
| Razor blades | |||
| Glass scintillation vials | Fisher scientific | 03-337-14 | |
| Glass slides | |||
| Eyelash tool | |||
| Metal Loop tool |
References
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