Альтернативный подход к Подготовка проб с низкой Количество сотовых для анализа ПЭМ
Summary
Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.
Abstract
Просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) содержит подробную информацию о клеточной организации и ультраструктуры. Тем не менее, ПЭМ анализ популяций редких клеток, особенно клеток в суспензии, таких как кроветворные стволовые клетки (ГСК), остается ограниченным из-за требования большого количества клеток при подготовке пробы. Есть несколько цитоспина или однослойные подходы для анализа ПЭМ из дефицитных образцов, но эти подходы не в состоянии получить значительные количественные данные из ограниченного числа клеток. Здесь, альтернативный и новый подход для подготовки проб в исследованиях ТЕМ описан для популяций редких клеток, что дает возможность количественного анализа.
Относительно низкое число клеток, то есть 10000 ГСК, был успешно применен для анализа ПЭМ по сравнению с миллионами клеток , обычно используемых для исследований ПЭМ. В частности, Эванс синий окрашивание проводили после того, как параформальдегид-глутаральдегид (PFA-GA) фиксации визуализировать крошечные ячейки PELпусть, что облегчало вложение в агарозы. наблюдались скопления многочисленных клеток в ультра-тонких срезов. Клетки были хорошо сохранившийся морфологии, и ультра-структурные детали комплекса Гольджи и несколько митохондрий были видны. Это эффективный, простой и воспроизводимый протокол позволяет Пробоподготовка из ряда низких клеток и могут быть использованы для качественного и количественного анализа ПЭМ на редких клеточных популяций из ограниченных биологических образцов.
Introduction
Ультра-структурные и суб-органелл клеток детали были в основном выявлены с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) исследований из тканей или клеточных гранул 1,2. Твердые куски ткани могут быть легко использованы для исследований методами электронной микроскопии. Тем не менее, анализ ТЭМ 1,3 на клетках в суспензии остаются сложными и требуют высокого числа клеток, то есть миллионы клеток. Из – за этого, ультра-структурный анализ популяций редких клеток в суспензии, например, гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), которые не так легко оценить. Многочисленные попытки анализа ПЭМ из дефицитных образцов с использованием цитоспина или однослойных подходы не в состоянии получить значительные количественные данные, из-за ограниченного количества клеток. Таким образом, требование высоким числом клеток ограничивает использование этого мощного инструмента для понимания субклеточных ультраструктурным детали популяций редких клеток.
Ключевым ограничением для ПЭМ с ограниченным числом клетокs в суспензии является локализация клеток для обработки и, таким образом, ПЭМ исследования из ограниченных ячеек с особо малыми размерами оставаться сложной. Несколько альтернативных подходов были приняты для борьбы с этим ограничение: БСА / бисакриламида (БСА-BA) опосредованного полимеризации клеточной суспензии, окрашивание клеток с красителем, чтобы сделать их видимыми на тонкой пленки поддержки, включая покровные, и ПЭМ анализы из цитоспиновых препаратов 4-6. Тем не менее, весьма ограниченный успех был достигнут, так как очень немногие клетки были обнаружены в секциях после ультра-секционирования. Основная задача идентификации разреженные клеток сохраняется, поскольку клеточный монослой остается в основном невидимым в затвердевшего геля для секционирования. Кроме того, цитоспина подготовка клеток может изменить свою клеточную организацию из-за распространения клеток и хрупкости клеточной структуры. Следовательно, эти недостатки, присущие гарантирует новый подход к выполнению исследований ПЭМ из популяций редких клеток с болееконсистенции. Чтобы преодолеть эту проблему, мы описали новый и способ получения альтернативный образец для исследований ПЭМ из редких клеточных популяций 7.
Здесь мы сообщаем эффективный протокол подготовки образца для выполнения ПЭМ из дефицитных биологических образцов с последовательными качественных и количественных результатов. Эванс синий окрашивание проводили после фиксации , чтобы локализовать крошечное осадок клеток из клеток с низким числом, то есть 10000 костного мозга и гемопоэтических стволовых клеток – предшественников , которые в противном случае остались невидимы, и осадок вкладывается в агарозе до того обезвоживания и смолы внедрения процессов. Этот метод кластеров клетки вместе и позволяет проводить эффективный анализ ультраструктуры и субклеточных организации гемопоэтических стволовых клеток (обозначенном как Lin – Sca-1 + C-Kit + Flt3 – CD34 -; ГСК), редкий 0,2 – 0,5% популяции клеток в костном мозге. Этот экспериментальный протокол может быть полезным для выполнения ультра-структурных исследований и получить количественные результаты на многих редких, но очень важных групп населения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот метод позволяет проводить анализ ПЭМ на низких числа клеток, с помощью синего Эванса окрашивания и агарозы вложения, чтобы локализовать крошечное клеточный осадок во время дегидратации, смолы и вложении секционирования процессов. Важно то, что он поддерживает кластеры клеток вме…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Pathology Research Core for assistance with electron microscope analysis studies at Cincinnati Children’s Hospital Medical Center. The work was supported by NIH (American Society of Hematology Bridge award to-MDF; R01 DK102890 to MDF).
Materials
| Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 15713 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 16350 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Cacodyladate buffer | Electron microscopy Sciences | 12300 | Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4°C. CAUTION Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood. |
| Evans Blue | Sigma | E-2129 | |
| Low melting agarose | Sigma Aldrich | A-5030 | |
| Osmium tetraoxide | Electron microscopy Sciences | 19130 | 1 gm in 50 ml of 0.1M Cacodyladate buffer to make 2% OsO4 stock, CAUTION Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood. |
| LX-112 Embedding Kits (LADD®) | |||
| DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride) | LADD | 21340 | Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30 |
| NMA (Nadic methyl anhydride) | LADD | 21350 | |
| Epoxy Resins Epon 812 (LX-112) | LADD | 21310 | CAUTION Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood. |
| DMP-30 (2,4,6 -Tri(dimethylaminomethyl)phenol) | LADD | 21370 | |
| Reynolds lead citrate (EM Stain II) | Leica | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. | |
| Uranyl acetate (EM Stain I) | Leica | 8072820 | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ATCC | 30-2005 | composition: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. For for details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx |
| Pyramid tip mold | Ted Pella | 10585 | |
| mounting cylinders | Ted Pella | 10580 | |
| Ultra-microtome | (Leica EM UC7) | ||
| 200 mesh grids (nikil) | Electron microscopy Sciences | G-200 Ni | |
| Electron Microscope | Hitachi model H-7650 | ||
| Image capture engine software | AMT-600 | ||
| 35 mm plastic petri dishes | Fisher scientific | ||
| Quick Bond Super glue Cyanoacrylate | Electron microscopy Sciences | 72588 | |
| Razor blades | |||
| Glass scintillation vials | Fisher scientific | 03-337-14 | |
| Glass slides | |||
| Eyelash tool | |||
| Metal Loop tool |
References
- Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).
- Leapman, R. D. Novel techniques in electron microscopy. Curr Opin Neurobiol. 14, 591-598 (2004).
- Anderson, D. R. A method of preparing peripheral leucocytes for electron microscopy. J Ulstract Res. 13, 263-268 (1965).
- Taupin, P. Processing scarce biological samples for light and transmission electron microscopy. Eur J Histochem. 52, 135-139 (2008).
- Mather, J., Stanbridge, C. M., Butler, E. B. Method for the removal of selected cells from cytological smear preparations for transmission electron microscopy. J Clin Pathol. 34, 1355-1357 (1981).
- Oorschot, V., de Wit, H., Annaert, W. G., Klumperman, J. A novel flat-embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation. J Histochem Cytochem. 50, 1067-1080 (2002).
- Kumar, S., Ciraolo, G., Hinge, A., Filippi, M. D. An efficient and reproducible process for transmission electron microscopy (TEM) of rare cell populations. J Immunol Methods. 404, 87-90 (2014).
- Chen, J., et al. Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice. Exp Hematol. 36, 1236-1243 (2008).
- Hopwood, D. The reactions between formaldehyde, glutaraldehyde and osmium tetroxide, and their fixation effects o bovine serum albumin and on tissue blocks. Histochemistry. 24, 50-64 (1970).
- Saini, R., et al. Nitric oxide synthase localization in the rat neutrophils: immunocytochemical, molecular, and biochemical studies. J Leukoc Biol. 79, 519-528 (2006).
- Kumar, S., et al. The small GTPase Rap1b negatively regulates neutrophil chemotaxis and transcellular diapedesis by inhibiting Akt activation. J Exp Med. 211, 1741-1758 (2014).
